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《柑橘黃龍病菌及與其混合發(fā)生病毒的分子特性及超低溫脫除研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文柑橘黃龍病菌及與其混合發(fā)生病毒的分子特性及超低溫脫除研究姓名：丁芳申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：植物病理學(xué)指導(dǎo)教師：王國平;易干軍20060601柑橘黃龍病菌分子第定及0其混合發(fā)生的幾種癇毒分于柃刪技術(shù)研究中文摘要柑橘黃龍病(CitrusHuanglongbing，HLB)是世界性柑橘生產(chǎn)上的毀滅性病害。易與其混合發(fā)生的幾種柑橘病毒病及類似病害主要包括衰退病、裂皮病和碎葉??；病原分別為Citrustristezavirus(CTV)，Citrusexocortisviro耐(CEVd)
2、，Citrustatterleafvirus(CTLV)。本研究主要以HLB病菌、CTV、CEVd、CTLV為對象，從生物學(xué)角度及分子水平上對其部分特性進(jìn)行研究；目的是建立上述4種病原的高靈敏度的分子檢測技術(shù)體系；在分子水平上明確其部分分子特性。另外初步探討運用超低溫技術(shù)脫除HLB病菌、CTV、CEVd的可能性及機(jī)理。主要獲得結(jié)果如下：1．HLB病菌生物學(xué)鑒定及PCR檢測體系優(yōu)化。以長春花和椏柑為指示植物，部分待檢材料表現(xiàn)了明顯HLB癥狀。通過對影響PCR技術(shù)的各個主要因素的調(diào)整，建立了HLB病菌PCR
3、、Semi-NestedPCR及Nested-PCR檢測技術(shù)；并對三種方法的檢測靈敏度進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Semi-NestedPCR及Nested．PCR檢測靈敏度遠(yuǎn)高于常規(guī)PCR，是常規(guī)PCR的104倍。運用Nested-PCR技術(shù)在黃皮上檢測出HLB病菌(CandidatusLiberobacterasiaticus)，在國內(nèi)外屬于首次報道．2．不同引物檢測HLB病菌靈敏度比較。對基于rplA／rplK，13-operon，16SrDNA和16S／23SrDNA不同基因組序列設(shè)計的5對引物依次為fP
4、400／rP400，fP535／rP535，￡A2，rJ5，賊1／rOl2e，fol2／r23S1檢測HLB病菌靈敏度進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同引物檢測靈敏度不一樣，其檢測靈敏度由高到低依次為：fP400／rP400>fP535／rP535>酗2／訂5>fOll／rOl2c>fOl2／r23S1。3．HLB菌亞洲株系分子鑒定。HLB病菌16srDNA片段RFLP．SSCP分析及基于16SrDNA序列中國柑橘黃龍病菌屬分類地位的確立，分析結(jié)果顯示來自中國7省區(qū)9個代表性的分離物16SrDNA高度保守，全部屬
5、于亞洲菌系(CandidatusLiberobaeterasiaticus)。HLB病菌16S／23SrDNA間區(qū)序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示：來自中國7省區(qū)分布在不同的寄主體內(nèi)、導(dǎo)致寄主表現(xiàn)不同癥狀的18個分離物在該區(qū)段沒有發(fā)生顯著變異，各分離物之間的同源性達(dá)99％以上，全部與亞洲菌系(CandidatusLiberobacterasiaticus)高度同源，而與非洲菌系(CandidatusLiberobacterafricanum)差異較大。4．HLB病菌Southernblotting檢測。
6、利用a．32P．dC'l-p標(biāo)記16SrDNA探針進(jìn)行HLB病菌Dot，blotting檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Dot-blotting檢測靈敏度高于常規(guī)PCR而低于Semi-NestedPCR及Nested-PCR，最低檢測下限為30龜總核酸。5．CTV生物學(xué)鑒定、RT-PCR檢測技術(shù)的建立及來自不同寄主的21個分離物3’端、5’端分子特性分析。以墨西哥萊檬和甜橙為指示植物，待檢樣品表現(xiàn)典型的CTV致病癥狀。核苷酸序列多重比對分析結(jié)果顯示：21個CTV分離物的5’端和3’端共4個變異區(qū)(A區(qū)，F(xiàn)區(qū)，CP，P20
7、)存在明顯的差異。A區(qū)的核苷酸序列華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2006屆博十學(xué)位論文相似性最低。為95．92％；F區(qū)的核苷酸序列相似性最高，平均可達(dá)98．01％；CP，P20區(qū)的核苷酸序列相似性分別為97．20％，96．39％。21個分離物與GenBank中9個代表性的CTV分離物相應(yīng)區(qū)段的核苷酸序列平均相似性分別為84．21％，96．12％，96．25％，95．48％，說明CTV分離物之間在A，F(xiàn)，CP，P204個區(qū)段核苷酸序列存在較大差異。6．CEVd生物學(xué)鑒定及RT-PCR檢測技術(shù)建立。以Etrog香櫞為指示植物
8、，待檢樣品表現(xiàn)典型的CEVd致病癥狀。廣東、意大利、重慶中柑所分離物全長eDNA克隆及序列分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)：6個CEVd分離物核苷酸序列相互之間具有明顯的差異，同源性介于95．1％．99．2％之『日J(rèn)；重慶中柑所分離物ZGS-ZK與意大利分離物Italy．BL核苷酸序列同源性為98．4％，可初步劃歸為相近的株系；廣東分離物XNM．HJ與其它3個分離物核苷酸序列同源性差異在3％左右，因此極有可能為2個不同的株系。7．CTLV生物學(xué)鑒定、RT-PC
