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1、產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的篩選及其純化和穩(wěn)定性研究陳 沛，王雪青，阮海華天津師范大學(xué)學(xué)報，2011,32（2）：82-85細(xì)菌素（Bacteriocin）是由某些細(xì)菌在代謝過程中產(chǎn)生的一類具有抑菌作用的蛋白質(zhì)或多肽，常表現(xiàn)為對同種或近源菌種有特異性的抑制作用。乳酸菌指發(fā)酵糖類主要產(chǎn)物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏染色陽性細(xì)菌的總稱。凡是能從葡萄糖或乳糖的發(fā)酵過程中產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌統(tǒng)稱為乳酸菌。（革蘭氏陽性球菌，短鏈．在MRS平板上生長呈圓形、直徑約1.2mm、乳白色、低凸起、邊緣整齊、不透明的光滑型菌落。)乳酸菌
2、在利用乳糖或葡萄糖的代謝過程中，伴隨乳酸酵，可產(chǎn)生很多物質(zhì)，如有機酸、過氧化氫和細(xì)菌素等，具有抑制腐敗菌生長的特點，是健康人和動物腸道的優(yōu)勢菌群之一，對于維持腸道微環(huán)境的穩(wěn)定與健康發(fā)揮著重要的作用。腸內(nèi)乳酸菌種植種群與健康長壽有著非常密切關(guān)系。乳酸細(xì)菌素抑菌譜與產(chǎn)生菌密切相關(guān)，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的乳酸菌細(xì)菌素有40余種，但廣泛應(yīng)用的只有乳酸鏈球菌素（Nisin），因此研發(fā)具有廣譜抗菌作用的新型乳酸菌細(xì)菌素具有十分重要的意義。嬰兒糞便中的乳酸菌，與其他材料相比無論是在數(shù)量還是種屬上，都占據(jù)十分重要的優(yōu)勢地位。
3、試驗方法與討論材料產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌株的分離生物學(xué)特性選育細(xì)菌素的熱穩(wěn)定性細(xì)菌素的酸堿穩(wěn)定性細(xì)菌素對胰蛋白酶的敏感性細(xì)菌素在不同pH條件下的熱穩(wěn)定性結(jié)論試驗方法與討論材料實驗菌種：大腸桿菌（Escherichiacoli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、藤黃微球菌（Micrococcusluteus）、單增李斯特菌（Listera）、枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）、志賀氏菌（Shigella）、沙門氏菌（Salmonella），均來自天津商業(yè)大學(xué)微生物教
4、研室．培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、CM502培養(yǎng)基，溴甲酚紫MRS鑒定培養(yǎng)基．產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌株的分離菌種初篩將采集到的嬰兒糞便用生理鹽水進行10倍遞增稀釋，得到稀釋度分別為10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6的樣品，并將其均勻地涂布于含有0.02g/mlCaCO3的MRS平板上，于30℃培養(yǎng)48h，挑取有溶鈣圈的單菌落于含有溴甲酚紫的MRS培養(yǎng)基劃線分離，反復(fù)純化．挑取單菌落進行革蘭氏染色，鏡檢，觀察乳酸菌的形態(tài)及顏色是否一致。抑菌試驗采用牛津杯法進行篩選按體積分?jǐn)?shù)1%
5、接種30℃，48h連續(xù)培養(yǎng)3代離心（4℃，15min）上清用0.22μm濾膜過濾,濾液用1MNaOH調(diào)節(jié)pH7.0指示菌培養(yǎng)液OD600=0.1取100μL涂布LB培養(yǎng)基（李斯特菌涂布于CM502培養(yǎng)基）乳酸菌5mLMRS培養(yǎng)基復(fù)篩連續(xù)培養(yǎng)3代60%硫酸銨沉淀液體MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)離心，過濾高速離心沉淀乙酸鈉復(fù)溶過HitrapSPHP(GE)陽離子交換柱菌種復(fù)篩抑菌試驗(F-6-B)生物學(xué)特性選育細(xì)菌素的熱穩(wěn)定性以金黃色葡萄球菌為指示菌，以未經(jīng)處理的發(fā)酵液為陽性對照，MRS培養(yǎng)基為空白對照，以抑菌圈
6、直徑的大小反映該細(xì)菌素的酸堿穩(wěn)定性細(xì)菌素的酸堿穩(wěn)定性將發(fā)酵液用HCL和NaOH調(diào)節(jié)到不同的pH值，于25℃處理2h，金黃色葡萄球菌為指示菌，MRS培養(yǎng)基為空白對照，以抑菌圈直徑的大小反映該細(xì)菌素的酸堿穩(wěn)定性。細(xì)菌素在不同pH條件下的熱穩(wěn)定性將F-6-B菌株發(fā)酵離心上清液分別調(diào)至不同的pH值，然后在不同的溫度下處理不同的時間，最后回調(diào)至中性環(huán)境，以未經(jīng)處理的原液作為對照，檢測抑菌活性。細(xì)菌素對胰蛋白酶的敏感性用5mg/ml胰蛋白酶對發(fā)酵液處理2h，MRS培養(yǎng)為空白對照，以抑菌圈直徑的大小反映該細(xì)菌素
7、對胰蛋白酶的敏感性。結(jié)論利用從30個健康嬰兒中分離得到的一株產(chǎn)廣譜細(xì)菌素的乳酸菌（F-6-B），通過排除發(fā)酵液上清中有機酸和過氧化氫的影響，初步證明F-6-B產(chǎn)生的是一種細(xì)菌素，該細(xì)菌素的抑菌活性與Nisin相似。對該乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素進行了初步研究，從對該細(xì)菌素的耐酸堿，熱穩(wěn)定以及蛋白酶敏感等實驗，發(fā)現(xiàn)該細(xì)菌素在酸堿環(huán)境下均具有很強的抑菌作用和很好的熱穩(wěn)定性，即使在121℃加熱15min的條件下，仍有抑菌活性，并且表現(xiàn)對胰蛋白酶不敏感．與目前在食品加工中廣泛使用的Nisin相比，由于其較好的熱穩(wěn)
8、定性和酸堿穩(wěn)定性，使其具有更好的加工特性，預(yù)示著該細(xì)菌素在食品生物防腐劑等方面，具有潛在應(yīng)用價值。Thankyou！帖航天津商業(yè)大學(xué)生物工程1001
