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《目的基因的原核誘導(dǎo)表達及SDS-PAGE凝膠電泳》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、目的基因的原核誘導(dǎo)表達及SDS-PAGE凝膠電泳現(xiàn)代分子生物學(xué)大實驗實驗?zāi)康闹攸c掌握表達載體構(gòu)建的原理及方法掌握目的基因原核誘導(dǎo)表達的原理及方法了解目的蛋白質(zhì)“標(biāo)簽”純化的基本原理和方法掌握PAGE變性凝膠電泳的原理及方法掌握考馬斯亮藍染色的方法目的蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達目的蛋白質(zhì)的純化目的蛋白質(zhì)的檢測實驗原理蛋白質(zhì)的表達：將克隆基因插入合適載體后導(dǎo)入宿主細(xì)胞表達大量蛋白質(zhì)的方法。體內(nèi)很難分析單個蛋白質(zhì)的作用進行大量表達和純化是為了在體外進行研究應(yīng)用于蛋白純化、定位及功能分析等方面實驗原理圖pET14b-His-TAT-EGFP-
2、p38-16peptides融合蛋白在Hela細(xì)胞中的熒光顯微鏡檢測（×400）例酵母表達系統(tǒng)昆蟲表達系統(tǒng)哺乳動物細(xì)胞表達系統(tǒng)表達的蛋白具有正常的活性、構(gòu)象技術(shù)難度較大、耗時、耗資大腸桿菌表達系統(tǒng)實驗技術(shù)簡單，時間較短，費用低，系統(tǒng)比較完備不能有效地對重組蛋白質(zhì)進行修飾加工，易形成包涵體原核細(xì)胞表達系統(tǒng)真核細(xì)胞表達系統(tǒng)實驗原理原核細(xì)胞表達系統(tǒng)菌株菌株內(nèi)源的蛋白酶過多，可能會造成外源表達產(chǎn)物的不穩(wěn)定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成為理想的起始表達菌株。堪稱經(jīng)典的BL21系列就是lon和ompT蛋白酶缺陷型，也是我們非常熟悉的表
3、達菌株。大名鼎鼎的BL21(DE3)融源菌則是添加T7聚合酶基因，為T7表達系統(tǒng)而設(shè)計。實驗原理原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建目的基因表達載體PlasmidTaglacIqPromoterAmpr多克隆位點實驗原理目的基因/DNA/PCR/酶切/Primer例：p38中抑制多肽16肽序列GGAAGAACATTGTTTCCTGGTACAGACCATATTGATCAGTTGAAGCTCF5’-ACGGATCCTAGGAAGAACATTGTTTCCTGGT-3’R5’-ACGGATCCTTAGAGCTTCAACTGATCAATATGG-3’5
4、’端引物中AC是隨機保護堿基，GGATCC是BamHI酶切位點，TA是為防止移碼而引入的兩個堿基，隨后是編碼16肽前7個氨基酸的堿基序列。3’端引物中AC是隨機保護堿基，GGATCC是BamHI酶切位點，TAA是終止密碼子的反向互補序列，隨后是從編碼16肽堿基序列的最后一個堿基開始的反向互補序列。實驗原理表達載體能將外源基因運載到大腸桿菌細(xì)胞中;在基本骨架的基礎(chǔ)上增加表達元件，就構(gòu)成了表達載體。元件啟動子、終止子、核糖體識別序列誘導(dǎo)性表達所需要的元件操縱子序列調(diào)控基因多克隆位點融合Tag復(fù)制起始序列篩選標(biāo)記/報告基因各種表達
5、載體的不同之處在于其表達元件的差異。實驗原理啟動子的強弱是對表達量有決定性影響的因素之一。從轉(zhuǎn)錄模式上看有組成型表達和誘導(dǎo)調(diào)控型表達。lac和Tac，PL和PR，T7是最常用的啟動子，轉(zhuǎn)錄終止子核糖體結(jié)合位點啟動子、終止子、核糖體識別序列操縱子序列及配套的調(diào)控基因誘導(dǎo)性表達所需要的元件多克隆位點 復(fù)制起始序列實驗原理用作分離的載體蛋白被稱為標(biāo)簽蛋白或標(biāo)簽多肽（Tag）。標(biāo)簽位于表達載體的多克隆位點的N端或者C端，能夠與目的基因融合表達（N端或者C端融合表達）。目前常用的標(biāo)簽有組氨酸標(biāo)簽（His-Tag）谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（gl
6、utathioneStransferase）標(biāo)簽（GST-Tag）硫氧還蛋白（thioredoxin,Trx）標(biāo)簽麥芽糖結(jié)合蛋白（MaltoseBindingProtein,MBP）蛋白質(zhì)A（proteinA）纖維素結(jié)合位點（cellulosebindingdomain）標(biāo)簽等。一般對于小分子用較大的Tag（如GST）以獲得穩(wěn)定表達；而一般的基因多選擇小Tag（如His）減少對目的蛋白的影響。實驗原理篩選標(biāo)記/報告基因表達抗藥性基因，Amp是最常見的篩選標(biāo)記，kana，新霉素，四環(huán)素，紅霉素和氯霉素?？剐曰虻倪x擇要注意是否
7、會對研究對象產(chǎn)生干擾，比如代謝研究中要留意抗性基因編碼的酶是否和代謝物相互作用。GFP（綠色熒光蛋白）是最常用的報告基因了，半乳糖苷酶，熒光素酶。一些融合表達Tag也有報告基因的功能。實驗原理常用表達載體pGEX系列載體是谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）融合蛋白表達系統(tǒng)的載體。PtacPromoterAmppGEX-KGpET系列的載體是His6融合蛋白的表達載體。T7KanapET-14b實驗原理目的蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達lacIq（Lactose）lacI是大腸桿菌中l(wèi)ac操縱子（Operon）的調(diào)節(jié)基因，它所表達的阻遏蛋白是la
8、c操縱基因（Operator）的抑制因子，抑制轉(zhuǎn)錄啟動。當(dāng)有乳糖存在時，這種阻遏蛋白能與過量的乳糖結(jié)合而失去對操縱基因的抑制，使lac操縱子上的結(jié)構(gòu)基因lacZ（β-半乳糖苷酶)、lacY（透性酶)、lacA(乙?；D(zhuǎn)移酶）得以正常表達，啟動轉(zhuǎn)錄。IPTG（異丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷
