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《目的基因的原核誘導表達及SDS-PAGE凝膠電泳》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在教育資源-天天文庫。
1、目的基因的原核誘導表達及SDS-PAGE凝膠電泳現(xiàn)代分子生物學大實驗實驗目的重點掌握表達載體構建的原理及方法掌握目的基因原核誘導表達的原理及方法了解目的蛋白質“標簽”純化的基本原理和方法掌握PAGE變性凝膠電泳的原理及方法掌握考馬斯亮藍染色的方法目的蛋白質的誘導表達目的蛋白質的純化目的蛋白質的檢測實驗原理蛋白質的表達：將克隆基因插入合適載體后導入宿主細胞表達大量蛋白質的方法。體內很難分析單個蛋白質的作用進行大量表達和純化是為了在體外進行研究應用于蛋白純化、定位及功能分析等方面實驗原理圖pET14b-His-TAT-EGFP-
2、p38-16peptides融合蛋白在Hela細胞中的熒光顯微鏡檢測（×400）例酵母表達系統(tǒng)昆蟲表達系統(tǒng)哺乳動物細胞表達系統(tǒng)表達的蛋白具有正常的活性、構象技術難度較大、耗時、耗資大腸桿菌表達系統(tǒng)實驗技術簡單，時間較短，費用低，系統(tǒng)比較完備不能有效地對重組蛋白質進行修飾加工，易形成包涵體原核細胞表達系統(tǒng)真核細胞表達系統(tǒng)實驗原理原核細胞表達系統(tǒng)菌株菌株內源的蛋白酶過多，可能會造成外源表達產(chǎn)物的不穩(wěn)定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成為理想的起始表達菌株?？胺Q經(jīng)典的BL21系列就是lon和ompT蛋白酶缺陷型，也是我們非常熟悉的表
3、達菌株。大名鼎鼎的BL21(DE3)融源菌則是添加T7聚合酶基因，為T7表達系統(tǒng)而設計。實驗原理原核表達質粒的構建目的基因表達載體PlasmidTaglacIqPromoterAmpr多克隆位點實驗原理目的基因/DNA/PCR/酶切/Primer例：p38中抑制多肽16肽序列GGAAGAACATTGTTTCCTGGTACAGACCATATTGATCAGTTGAAGCTCF5’-ACGGATCCTAGGAAGAACATTGTTTCCTGGT-3’R5’-ACGGATCCTTAGAGCTTCAACTGATCAATATGG-3’5
4、’端引物中AC是隨機保護堿基，GGATCC是BamHI酶切位點，TA是為防止移碼而引入的兩個堿基，隨后是編碼16肽前7個氨基酸的堿基序列。3’端引物中AC是隨機保護堿基，GGATCC是BamHI酶切位點，TAA是終止密碼子的反向互補序列，隨后是從編碼16肽堿基序列的最后一個堿基開始的反向互補序列。實驗原理表達載體能將外源基因運載到大腸桿菌細胞中;在基本骨架的基礎上增加表達元件，就構成了表達載體。元件啟動子、終止子、核糖體識別序列誘導性表達所需要的元件操縱子序列調控基因多克隆位點融合Tag復制起始序列篩選標記/報告基因各種表達
5、載體的不同之處在于其表達元件的差異。實驗原理啟動子的強弱是對表達量有決定性影響的因素之一。從轉錄模式上看有組成型表達和誘導調控型表達。lac和Tac，PL和PR，T7是最常用的啟動子，轉錄終止子核糖體結合位點啟動子、終止子、核糖體識別序列操縱子序列及配套的調控基因誘導性表達所需要的元件多克隆位點 復制起始序列實驗原理用作分離的載體蛋白被稱為標簽蛋白或標簽多肽（Tag）。標簽位于表達載體的多克隆位點的N端或者C端，能夠與目的基因融合表達（N端或者C端融合表達）。目前常用的標簽有組氨酸標簽（His-Tag）谷胱甘肽S轉移酶（gl
6、utathioneStransferase）標簽（GST-Tag）硫氧還蛋白（thioredoxin,Trx）標簽麥芽糖結合蛋白（MaltoseBindingProtein,MBP）蛋白質A（proteinA）纖維素結合位點（cellulosebindingdomain）標簽等。一般對于小分子用較大的Tag（如GST）以獲得穩(wěn)定表達；而一般的基因多選擇小Tag（如His）減少對目的蛋白的影響。實驗原理篩選標記/報告基因表達抗藥性基因，Amp是最常見的篩選標記，kana，新霉素，四環(huán)素，紅霉素和氯霉素?？剐曰虻倪x擇要注意是否
7、會對研究對象產(chǎn)生干擾，比如代謝研究中要留意抗性基因編碼的酶是否和代謝物相互作用。GFP（綠色熒光蛋白）是最常用的報告基因了，半乳糖苷酶，熒光素酶。一些融合表達Tag也有報告基因的功能。實驗原理常用表達載體pGEX系列載體是谷胱甘肽S-轉移酶（GST）融合蛋白表達系統(tǒng)的載體。PtacPromoterAmppGEX-KGpET系列的載體是His6融合蛋白的表達載體。T7KanapET-14b實驗原理目的蛋白質的誘導表達lacIq（Lactose）lacI是大腸桿菌中l(wèi)ac操縱子（Operon）的調節(jié)基因，它所表達的阻遏蛋白是la
8、c操縱基因（Operator）的抑制因子，抑制轉錄啟動。當有乳糖存在時，這種阻遏蛋白能與過量的乳糖結合而失去對操縱基因的抑制，使lac操縱子上的結構基因lacZ（β-半乳糖苷酶)、lacY（透性酶)、lacA(乙?；D移酶）得以正常表達，啟動轉錄。IPTG（異丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷
