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1、丙酮酸發(fā)酵實(shí)驗(yàn)1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)掌握利用發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸的原理,掌握丙酮酸、殘?zhí)呛途w濃度的測(cè)定方法和工藝操作。2.實(shí)驗(yàn)原理丙酮酸是機(jī)體代謝的中間產(chǎn)物,既處于糖酵解(EMP)途徑的末端,又是連接EMP途徑和TCA循環(huán)的關(guān)鍵產(chǎn)物,它可經(jīng)多條途徑生成乙醇、乳酸、草酰乙酸、丙氨酸、纈氨酸和異亮氨酸等。因此其所處的位置極為特殊。根據(jù)代謝控制育種和發(fā)酵原理,要想在生物體內(nèi)大量積累丙酮酸,就必須進(jìn)一步切斷或更確切地說是減弱丙酮酸的進(jìn)一步代謝支路,加速丙酮酸的合成速度,去除代謝產(chǎn)物的反饋?zhàn)瓒艋蚍答佉种疲▓D1)。葡萄糖甘油NA異亮氨酸,纈氨酸磷酸烯醇式丙酮酸
2、B1B1ADHNAPDC乙醇NA乙醛乳酸丙酮酸NALDHAIDHPDC乙酸NAB1PdxACS乙酰輔酶A丙氨酸草酰乙酸Pdx谷氨酰胺α-酮戊二酸谷氨酸加速代謝流切斷或減弱圈內(nèi)為輔酶或輔基(NA表示煙酸,B1為硫胺素,Bio為生物素,Pdx為吡哆醇。圖1丙酮酸的代謝途徑及發(fā)酵機(jī)制3實(shí)驗(yàn)儀器與材料5L自動(dòng)控制發(fā)酵罐TGL-16G臺(tái)式高速離心機(jī) 752型紫外可見分光光度計(jì) 500mL三角瓶HZQ-Q恒溫振蕩器手提式壓力蒸汽滅菌器LRH-250A型生化培養(yǎng)箱SBA-40C型生物分析傳感儀實(shí)驗(yàn)菌種:煙酸、硫氨酸、生物素和吡哆醇缺陷型的光滑球擬酵母(T
3、orulopsisglabrata)種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖30,蛋白胨10,KH2PO41,MgSO4·7H2O0.5,pH5.6,自來水1L。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖80g/L,蛋白胨3g/L,硫酸銨5.9g/L,KH2PO41g/L,MgSO4·7H2O0.5g/L,煙酸8mg/L,鹽酸硫胺素20μg/L,生物素10μg/L,鹽酸吡哆醇0.5mg/L,金屬離子母液5mL/L,pH5.6。金屬離子母液:CaCL2·2H2O,2g,F(xiàn)eSO4·7H2O,2g;ZnCL2,5g,MnCL·4H2O,0.2g,CuSO4·5H2O,0
4、.5g,2mol/LHCL溶解后定溶至1L。4實(shí)驗(yàn)步驟與方法(1)種子培養(yǎng)取新鮮斜面菌種1環(huán),接入50mL種子培養(yǎng)基(500mL錐形瓶)中,30℃,200r/min振蕩培養(yǎng)20小時(shí)。(2)5L罐分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)①空消:空罐滅菌。②實(shí)消:將發(fā)酵培養(yǎng)基2.7L從進(jìn)樣口倒入5L發(fā)酵罐中,蓋上蓋子。檢查發(fā)酵罐安裝完好后,蓋上滅菌罩,105℃滅菌15分鐘。③校正:校正pH電極、溶氧電極(校正方法參考5L罐使用說明書)④接種與發(fā)酵:在接種圈的火焰保護(hù)下,將種子培養(yǎng)液300mL倒入發(fā)酵罐中,控制發(fā)酵溫度30℃,pH為6.0,溶氧:0-12h通風(fēng)60L/h,發(fā)
5、酵罐攪拌100r/min,12-72h停止通風(fēng)和攪拌。自動(dòng)流加8mol/LNaOH溶液控制發(fā)酵液pH為5.0±0.05,發(fā)酵過程產(chǎn)生的泡沫較多時(shí),手動(dòng)加入已滅菌的泡敵2-3滴即可迅速消泡,當(dāng)殘?zhí)菨舛鹊陀?g/L時(shí)發(fā)酵結(jié)束。⑤測(cè)量:每隔4h取樣,測(cè)菌體濃度、葡萄糖和丙酮酸濃度。在火焰下,按10%(v/v)接種量將種子接入發(fā)酵罐中,裝液量3L,通風(fēng)量1L/(L·min),發(fā)酵溫度30℃,通過調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速控制溶氧(DO):1-12h控制溶氧值為80~100%,12~控制溶氧值為70-80%。自動(dòng)流加8mol/LNaOH溶液控制發(fā)酵液pH為5.0±
6、0.05,發(fā)酵過程產(chǎn)生的泡沫較多時(shí),手動(dòng)加入已滅菌的泡敵2-3滴即可迅速消泡,當(dāng)殘?zhí)菨舛鹊陀?g/L時(shí)發(fā)酵結(jié)束。(3)分析方法①菌體干重的測(cè)定將含有4mL發(fā)酵液的塑料離心管置于臺(tái)式離心機(jī)中,于10000r/min下離心5min,放于電熱鼓風(fēng)干燥箱80℃烘干至衡重,計(jì)算出細(xì)胞干重。上清液用于測(cè)定殘?zhí)菨舛?、丙酮酸濃度。②葡萄糖的測(cè)定用SBA-40C型生物傳感儀檢測(cè)。將離心后的上清夜稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)(100倍),用進(jìn)樣器吸取25μL進(jìn)樣。③丙酮酸的測(cè)定取10mL丙酮酸發(fā)酵液,離心(4000r/min,10mL)除去菌體,取5mL離心后的上清液至于5
7、00mL容量瓶中,再加入5mL0.01mol/L的硫酸溶液進(jìn)行酸解,使有機(jī)酸游離出來,然后定容并取適量以0.45μm孔徑的濾膜過濾即得到待測(cè)樣液。采用反相色譜柱ODS-2HYPERSIL(250mm×4.6mm,5μm),以0.05mol/LNH4H2PO4(用H3PO4調(diào)pH2.6)作為流動(dòng)相,在流速1mL/min,波長(zhǎng)215nm下測(cè)定。5實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理發(fā)酵培養(yǎng)時(shí),按照一定的時(shí)間間隔取樣測(cè)定并記錄,結(jié)果如下表。時(shí)間/h葡萄糖濃度/(g/L)菌體干重/(g/L)丙酮酸濃度/(g/L)048121620242832364044486結(jié)果與討論(
8、1)按照上表給出的相應(yīng)數(shù)據(jù),以時(shí)間為橫坐標(biāo),表中數(shù)據(jù)為縱坐標(biāo)繪圖,分析各量的變化規(guī)律。(2)糖酸轉(zhuǎn)化率(%):生成丙酮酸的克數(shù)與消耗葡萄糖克數(shù)之比的百分?jǐn)?shù)。7.參考文獻(xiàn)(1)高年