丙酮酸發(fā)酵實驗

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1、丙酮酸發(fā)酵實驗1.實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)掌握利用發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸的原理，掌握丙酮酸、殘?zhí)呛途w濃度的測定方法和工藝操作。2.實驗原理丙酮酸是機體代謝的中間產(chǎn)物，既處于糖酵解（EMP）途徑的末端，又是連接EMP途徑和TCA循環(huán)的關(guān)鍵產(chǎn)物，它可經(jīng)多條途徑生成乙醇、乳酸、草酰乙酸、丙氨酸、纈氨酸和異亮氨酸等。因此其所處的位置極為特殊。根據(jù)代謝控制育種和發(fā)酵原理，要想在生物體內(nèi)大量積累丙酮酸，就必須進一步切斷或更確切地說是減弱丙酮酸的進一步代謝支路，加速丙酮酸的合成速度，去除代謝產(chǎn)物的反饋阻遏或反饋抑制（圖1）。葡萄糖甘油NA異亮氨酸，纈氨酸磷酸烯醇式丙酮酸

2、B1B1ADHNAPDC乙醇NA乙醛乳酸丙酮酸NALDHAIDHPDC乙酸NAB1PdxACS乙酰輔酶A丙氨酸草酰乙酸Pdx谷氨酰胺α-酮戊二酸谷氨酸加速代謝流切斷或減弱圈內(nèi)為輔酶或輔基（NA表示煙酸，B1為硫胺素，Bio為生物素，Pdx為吡哆醇。圖1丙酮酸的代謝途徑及發(fā)酵機制3實驗儀器與材料5L自動控制發(fā)酵罐TGL-16G臺式高速離心機　752型紫外可見分光光度計　500mL三角瓶HZQ-Q恒溫振蕩器手提式壓力蒸汽滅菌器LRH-250A型生化培養(yǎng)箱SBA-40C型生物分析傳感儀實驗菌種：煙酸、硫氨酸、生物素和吡哆醇缺陷型的光滑球擬酵母（T

3、orulopsisglabrata）種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30，蛋白胨10，KH2PO41，MgSO4·7H2O0.5，pH5.6，自來水1L。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖80g/L，蛋白胨3g/L，硫酸銨5.9g/L，KH2PO41g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，煙酸8mg/L，鹽酸硫胺素20μg/L，生物素10μg/L，鹽酸吡哆醇0.5mg/L，金屬離子母液5mL/L，pH5.6。金屬離子母液：CaCL2·2H2O，2g，F(xiàn)eSO4·7H2O，2g；ZnCL2，5g，MnCL·4H2O，0.2g，CuSO4·5H2O，0

4、.5g，2mol/LHCL溶解后定溶至1L。4實驗步驟與方法（1）種子培養(yǎng)取新鮮斜面菌種1環(huán)，接入50mL種子培養(yǎng)基（500mL錐形瓶）中，30℃，200r/min振蕩培養(yǎng)20小時。（2）5L罐分批發(fā)酵實驗①空消：空罐滅菌。②實消：將發(fā)酵培養(yǎng)基2.7L從進樣口倒入5L發(fā)酵罐中，蓋上蓋子。檢查發(fā)酵罐安裝完好后，蓋上滅菌罩，105℃滅菌15分鐘。③校正：校正pH電極、溶氧電極（校正方法參考5L罐使用說明書）④接種與發(fā)酵：在接種圈的火焰保護下，將種子培養(yǎng)液300mL倒入發(fā)酵罐中，控制發(fā)酵溫度30℃，pH為6.0,溶氧:0-12h通風(fēng)60L/h，發(fā)

5、酵罐攪拌100r/min，12-72h停止通風(fēng)和攪拌。自動流加8mol/LNaOH溶液控制發(fā)酵液pH為5.0±0.05，發(fā)酵過程產(chǎn)生的泡沫較多時，手動加入已滅菌的泡敵2-3滴即可迅速消泡，當殘?zhí)菨舛鹊陀?g/L時發(fā)酵結(jié)束。⑤測量：每隔4h取樣，測菌體濃度、葡萄糖和丙酮酸濃度。在火焰下，按10%(v/v)接種量將種子接入發(fā)酵罐中，裝液量3L，通風(fēng)量1L/(L·min)，發(fā)酵溫度30℃，通過調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速控制溶氧(DO)：1-12h控制溶氧值為80~100%，12~控制溶氧值為70-80%。自動流加8mol/LNaOH溶液控制發(fā)酵液pH為5.0±

6、0.05，發(fā)酵過程產(chǎn)生的泡沫較多時，手動加入已滅菌的泡敵2-3滴即可迅速消泡，當殘?zhí)菨舛鹊陀?g/L時發(fā)酵結(jié)束。（3）分析方法①菌體干重的測定將含有4mL發(fā)酵液的塑料離心管置于臺式離心機中，于10000r/min下離心5min,放于電熱鼓風(fēng)干燥箱80℃烘干至衡重，計算出細胞干重。上清液用于測定殘?zhí)菨舛取⒈釢舛?。②葡萄糖的測定用SBA-40C型生物傳感儀檢測。將離心后的上清夜稀釋適當?shù)谋稊?shù)(100倍)，用進樣器吸取25μL進樣。③丙酮酸的測定取10mL丙酮酸發(fā)酵液，離心（4000r/min,10mL）除去菌體，取5mL離心后的上清液至于5

7、00mL容量瓶中，再加入5mL0.01mol/L的硫酸溶液進行酸解，使有機酸游離出來，然后定容并取適量以0.45μm孔徑的濾膜過濾即得到待測樣液。采用反相色譜柱ODS-2HYPERSIL(250mm×4.6mm，5μm)，以0.05mol/LNH4H2PO4（用H3PO4調(diào)pH2.6）作為流動相，在流速1mL/min，波長215nm下測定。5實驗數(shù)據(jù)處理發(fā)酵培養(yǎng)時，按照一定的時間間隔取樣測定并記錄，結(jié)果如下表。時間／h葡萄糖濃度/(g/L)菌體干重/(g/L)丙酮酸濃度/(g/L)048121620242832364044486結(jié)果與討論（

8、1）按照上表給出的相應(yīng)數(shù)據(jù)，以時間為橫坐標，表中數(shù)據(jù)為縱坐標繪圖，分析各量的變化規(guī)律。（2）糖酸轉(zhuǎn)化率(%)：生成丙酮酸的克數(shù)與消耗葡萄糖克數(shù)之比的百分數(shù)。7.參考文獻（1）高年