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1、廣州師院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)JOURNALOFGUANGZHOUNORMALUNWERSflY《NATUR紅JSCIENCEEDFrION)第21卷一_第立塑No.3Vol.21高純度線粒體DNA的快速提取’,2,2梅玉屏傅先元葉成仁..,,(1廣東省中醫(yī)院中心試驗(yàn)室廣東廣州510120;2廣州師范學(xué)院生物系廣東廣州51叫。5),,摘要:報(bào)道了一種改進(jìn)的線粒體DNA(而tochon曲alDNA皿DNA)提取方法該方法不僅,,,使提取mtDNA的周期縮短了而且操作簡(jiǎn)便提取的線粒體DNA結(jié)構(gòu)完整并徹底避免了核、、、;DNA線杜體RNA蛋白質(zhì)有機(jī)溶劑等的
2、污染該方法還可以根據(jù)不同的試臉要求而選取。,、、、相應(yīng)的步驟與其他方法相比較該方法具有快速簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)產(chǎn)品純度高以及mtDNA結(jié)構(gòu)完整等特點(diǎn),mtl)。其得率和純度均能滿足NA的各種分析要求關(guān)鍵詞:線拉體DNA;l;堿變性法DNase.中圖分類號(hào):Q343文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):10[X)25%(2《X))仍碩洲刀壓以,線粒體是真核細(xì)胞中普遍存在的一種重要而獨(dú)特的細(xì)胞器對(duì)其遺傳相對(duì)獨(dú)立的。-自主性及生物發(fā)生的研究成為當(dāng)前細(xì)胞生物學(xué)中非?；钴S的領(lǐng)域川線粒體DNA(mtD、、、,NA)已被廣泛應(yīng)用于發(fā)病機(jī)理臨床診斷遺傳變異生物進(jìn)化等多方面的研究并。,只。
3、取得了許多有價(jià)值的結(jié)果線粒體基因組結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單有16腸左右[z]由于mtDNA的,,,。,-分子量小個(gè)體內(nèi)有高度的均一性無組織特異性[s]所以便于取材分析同時(shí)mtD,NA又具有廣泛的種內(nèi)和種間多態(tài)性在親緣關(guān)系相近的物種間其進(jìn)化速度比核基因。開,快L4J展動(dòng)物線粒體DNA結(jié)構(gòu)與功能的研究對(duì)深人了解生物體發(fā)育過程中基因與、、調(diào)控的分子機(jī)理核質(zhì)相互作用方式及分析生物種間種內(nèi)的進(jìn)化關(guān)系等都具有重要的”一7。,-意義〔〕趙興波認(rèn)為mtl〕NA在動(dòng)物育種研究中有廣泛的應(yīng)用[s]張四明通過對(duì)mtD、,NA的研究探討了方正銀螂白卿和腳的遺傳差異[9]曹瑩利用mtDN
4、A對(duì)尼羅非卿和奧。。利亞非卿遺傳差異進(jìn)行了研究〔‘0]md)NA分析直接從宏觀現(xiàn)象進(jìn)人到微觀分子水平。如何快速有效地提取mtl〕NA無疑成了進(jìn)行這些方面研究的前提已有的mtDNA提取方法、、、概括起來可分為密度梯度離心法酶消化法柱層析法氯化艷超速離心法和堿變性。,,,法有的試劑昂貴;這些方法中如氯化艷有的試驗(yàn)條件要求十分嚴(yán)格如堿變性、,。,;有的操作繁雜法酶消化法如密度梯度離心法本文應(yīng)用了其中的堿變性法對(duì)如。何快速高效地提取mtDNA進(jìn)行了探討:l8一一收稿日期男偽20:第3期梅玉屏等高純度線粒體DNA的快速提取1材料和方法1.1材料、、本文以中
5、華鱉(2城,sis)紅卿(‘d3ius)湘江野鯉(嘆甲瓦哪~心二.、.、甲勿L爪厲匆訊ng乞硯nty)湘卿(Caius繃山’at出L四倍體魚(兒加叩腸滋Ca~腸ng~二rit)、、.人)白卿(ca10aura。瀏)湘云卿(命ioauL、約心幾做幾妙)等動(dòng)戶~如ha~~腸、、,物的肝臟性腺脾臟和腎臟組織為材料其中每種材料均采用了新鮮的活體解剖獲得,;另有部分湘江野鯉和四倍體魚采用了經(jīng)過20℃冰凍的組織來進(jìn)行試驗(yàn)組織部分湘。卿和四倍體魚采用冰壺(4℃)經(jīng)短途運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室的方式來取材試驗(yàn)材料均取自湖南湘陰。,、。東湖漁場(chǎng)除湘云卿外每種動(dòng)物均選用了雌雄兩種
6、個(gè)體1.2溶液.,一,.:刃FLs,1SE緩沖夜025二l/L蔗糖3otn、HCI10minOFLN處EDTA25In犯l/LCaC犯,州7.5。.,一,.,.nSTM溶液:025nloUL蔗糖ro皿朋l/LsHCI05FLMgC貶pHSocTri..r:110,s一,1~,p1SrE溶液0251/L蔗糖roFLTriHCI1~l/LE以rAHSo.,.。nUoW05以通/LEDTApHS0一,·V:rol/LsI,10FLE0.巧LI,80o溶液TriHCNazNaC叫TEN.~~DTAha,。Vll%SDS含021加1/LNH(臨用前用ro%
7、S和1伽FLNa0H新配制)aoDSc:叮的十,c一。珊KA溶液其中含3FLK5,FLA。e珊DNasl溶液。仄DNase毛℃e的RNaseA溶液,.一,.X酚:05FL的sHcl>780取重蒸酚用InoTri飽和使其PH1.3操作程序,,,一(l)取289動(dòng)物組織于少量SE溶液中漂洗剪碎加約30而的SE溶液勻漿,,。以2以刃離心ro而n;取上清液以150rpm離心巧而n沉淀物為線粒體用sIMrpm。溶液洗一遍.,:e(2)以溶液體積與組織重量之比為02而19的,rM溶液懸浮線粒體加D刊公l溶,,」,液(終濃度達(dá)10拌g/耐)30℃溫浴30而n;
8、加EDTA溶液(終濃度為20ol/I)n,.,,:In混勻加溶液體積與組織重量之比為16而19的STE溶液搖勻以2。以〕印離心10。,,
