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1、MicroRNA在基因表達(dá)調(diào)控中的作用一.怎樣定義miRNA(成熟)1,長度為22nt的轉(zhuǎn)錄體.可通過northernblot等方法檢測得到.2,其前體為典型的發(fā)卡結(jié)構(gòu).miRNA位于發(fā)卡結(jié)構(gòu)的莖部分..3,通過Dicer酶的處理后生成.4,序列具有高度的保守性.二.miRNA的生成過程注意事項(xiàng):1,通過RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄生成.具有mRNA的結(jié)構(gòu)特征2,可以是多順反子結(jié)構(gòu).即一條pri-miRNA包含多個(gè)成熟miRNA的信息.3,在判斷一非編碼蛋白質(zhì)的mRNA是否生成miRNA時(shí),我們可以通過抑制Drosha的活性,觀察pri-miRNA的含量是否增加.4,miRN
2、A可來源于外顯子,也可來源于內(nèi)含子和非編碼序列.5.miRNA在基因組DNA上成族分布,處于同一族的miRNA常共表達(dá)三.miRNA的作用機(jī)制及功能作用機(jī)制:與靶基因mRNA3-非翻譯區(qū)通過不完全配對結(jié)合降低mRNA穩(wěn)定性或抑制靶基因的翻譯.此外,miRNA也可與5-非翻譯區(qū)和編碼區(qū)序列結(jié)合調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá).有文獻(xiàn)報(bào)道,miRNA可與mRNA3-非翻譯區(qū)的其他部位結(jié)合,升高mRNA的穩(wěn)定性.注意事項(xiàng):1,由于miRNA與靶序列是通過不完全配對結(jié)合,因此證實(shí)miRNA的靶基因成為一難點(diǎn).2,一種miRNA常有多個(gè)靶基因.功能:miRNA主要通過抑制它的靶基因來起調(diào)控作用
3、。miRNA的作用遍及生命體的發(fā)生、生長、發(fā)育、分化和死亡的過程。Lewis等人的預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，預(yù)測的miRNA的靶基因多數(shù)是參與轉(zhuǎn)錄、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、腫瘤發(fā)生的基因。雖然miRNA的作用也是特異的，特別是5'端的2～8個(gè)堿基，特異性的靶向與它的靶基因，但是與siRNA不同的是miRNA的特異性并不是那么強(qiáng)，在生物體內(nèi)往往一個(gè)miRNA作用于多個(gè)靶基因6.對于同一家族miRNA,其功能常具有互補(bǔ)作用.比如:在MYC誘導(dǎo)的B細(xì)胞淋巴瘤小鼠模型中,剔除miR-17-92族DNA序列可誘導(dǎo)凋亡,如果導(dǎo)入此族中的任意一種miRNA均可減輕細(xì)胞凋亡.7.不同miRNA可同時(shí)調(diào)節(jié)同一靶
4、mRNA1.miRNA與細(xì)胞增殖apoptosis轉(zhuǎn)錄因子p53miR-34aStress(H2O2,UV等)Proinflammatorycytokine轉(zhuǎn)錄因子NF-kBmiR-146(1)IL-1receptor-associatedkinase1(2)TNFreceptor-associatedfactor6抑制cytokinesignaling2.miRNA與細(xì)胞凋亡3.miRNA與細(xì)胞信號傳導(dǎo)四.microRNA表達(dá)的特點(diǎn)1,時(shí)間特異性在高等生物,microRNA的表達(dá)在生長發(fā)育的不同階段是不同的..2,組織特異性在不同的組織中,microRNA的表達(dá)不同
5、的四.尋找miRNA基因1.Forwardgenetics2.MiRNAcloning3.ComputationalapproachestomiRNAdiscovery五.檢測miRNA表達(dá)的方法1,Northern雜交2,?Real-timeRT-PCR3.基因芯片的方法六．怎樣預(yù)測miRNA的靶基因第一種方法:過表達(dá)或抑制miRNA的表達(dá),利用基因芯片篩選出差異表達(dá)基因.從這些差異表達(dá)的基因中,證實(shí)miRNA的靶基因.注意事項(xiàng):1.并非所有的差異表達(dá)基因都是miRNA的靶基因.許多差異基因表達(dá)的改變是由靶基因表達(dá)的改變而引起.miRNA轉(zhuǎn)錄因子p53P53的靶基因
6、P53的靶基因不是該miRNA的靶基因2.該方法不能證實(shí)miRNA所有的靶基因.根據(jù)miRNA與靶基因mRNA3’UTR的配對程度不同,miRNA可降解靶基因mRNA(配對程度高),也可不降解靶基因mRNA(配對程度低)但抑制mRNA的翻譯,第二種方法:由生物信息學(xué)預(yù)測miRNA的靶基因.預(yù)測miRNA靶基因的網(wǎng)站:http://www.microrna.org/mammalian/index.html.http://pictar.bio.nyu.edu/http://www.microrna.org/microrna/home.dohttp://www.target
7、scan.org/注意事項(xiàng):根據(jù)背景知識,選擇兩個(gè)或兩個(gè)以上網(wǎng)站均有預(yù)測的靶基因做進(jìn)一步分析七．怎樣證實(shí)miRNA的靶基因5’UTR3’UTRORFAAAAAAAAA靶基因mRNAPCR擴(kuò)增3’UTR克隆3’UTR到報(bào)告基因luciferase下游luciferase3’UTR報(bào)告載體將重組載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞,觀察過表達(dá)或抑制miRNA后,luciferase活性是否改變.為進(jìn)一步證實(shí)miRNA確實(shí)調(diào)節(jié)該靶基因,還需完成以下實(shí)驗(yàn)1,突變3’UTR上與miRNA結(jié)合序列(主要是種子序列),觀察突變后的3’UTR可否廢除miRNA對luciferase活性的影
