實(shí)驗(yàn)熒光顯微鏡及激光共聚焦顯微鏡使用

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1、實(shí)驗(yàn)七-1細(xì)胞熒光染色觀察與熒光顯微鏡的使用（示范：細(xì)胞形態(tài)觀察與暗視野顯微鏡的使用）實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c教學(xué)要求掌握熒光顯微鏡的成像基本原理及其使用；掌握暗視野顯微鏡的成像基本原理及其使用。熒光顯微鏡是一種較為常用的的光學(xué)顯微鏡，其基本原理是利用一定波長(zhǎng)的激發(fā)光對(duì)樣品進(jìn)行激發(fā)，使之產(chǎn)生一定波長(zhǎng)的熒光，從而用于對(duì)樣品結(jié)構(gòu)或其組分進(jìn)行定性、定位、定量觀察檢測(cè)。一、熒光顯微鏡的成像原理什么是熒光?物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時(shí)釋放出的光。即：物質(zhì)吸收短波光，發(fā)射出的長(zhǎng)波光。保持

2、固有的熒光特性熒光波長(zhǎng)＞激發(fā)波長(zhǎng)熒光強(qiáng)度極小于激發(fā)光的強(qiáng)度有不同程度的衰減熒光強(qiáng)度取決于激發(fā)光強(qiáng)度、被檢物濃度、熒光效率熒光的性質(zhì)優(yōu)點(diǎn)：檢出能力高對(duì)細(xì)胞的刺激小能進(jìn)行多重染色用途：物體構(gòu)造的觀察熒光的有無、色調(diào)比較進(jìn)行物質(zhì)判別發(fā)熒光量的測(cè)定對(duì)物質(zhì)定性、定量分析熒光顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)和用途熒光素的特性對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)或組分的定性、定位、半定量研究。作為生物大分子篩選與鑒定的標(biāo)記物。熒光顯微鏡技術(shù)在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用二、暗視野顯微鏡的成像原理通過特殊的暗視野聚光器，使照明光線改變途徑，不直接進(jìn)入物鏡，而是傾斜地照

3、射到樣品上，由樣品表面的繞射光線入射到物鏡內(nèi)，產(chǎn)生樣品的衍射圖象。三、試劑與器材青蛙、洋蔥、人正常肝組織切片和脂肪肝組織切片（HE染色）甲醇、1‰丫啶橙、濾紙、吸管、載玻片熒光顯微鏡、暗視野顯微鏡、普通光學(xué)顯微鏡四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和實(shí)驗(yàn)步驟蛙血細(xì)胞染色觀察：取少許蛙血→常規(guī)血涂片→涼干→甲醇固定10min→1‰丫啶橙染色5min→水洗→室溫干燥（濾紙擦干玻片底面）→熒光顯微鏡觀察（先低倍后高倍觀察）（可在同一玻片上觀察未熒光染色的血細(xì)胞）取洋蔥→撕取一小片內(nèi)表皮→平面單層鋪展于玻片上→室溫涼干→1‰丫啶橙

4、染色5min→水洗（用吸管，小心掉片）→室溫干燥（或用濾紙擦干）→熒光顯微鏡觀察暗視野顯微鏡觀察蛙血細(xì)胞（示范）觀察人正常肝組織切片和脂肪肝組織切片（HE染色）熒光顯微鏡要在光線盡量暗的環(huán)境下觀察。使用熒光顯微鏡時(shí)要注意不要直接觀察激發(fā)光源，保護(hù)眼睛。暗視野顯微鏡要在光線盡量暗的環(huán)境下觀察。五、注意事項(xiàng)六、作業(yè)與思考題：描述在熒光顯微鏡下所觀察到的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。繪圖比較人正常肝組織細(xì)胞和脂肪肝組織細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)七-2激光掃描共聚焦顯微鏡在生命科學(xué)中的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求1.掌握激光掃描共聚焦顯微鏡的成像基本原

5、理及其在生命科學(xué)中的應(yīng)用。LaserScanningConfocalMicroscope普通熒光顯微鏡的不足使用熒光物質(zhì)標(biāo)記細(xì)胞中的特定成分或結(jié)構(gòu)，不僅圖像與對(duì)比度增強(qiáng)，而且由于許多熒光顯微鏡的光源使用短波長(zhǎng)的紫外光，大大提高了分辯率（δ=0.61λ/NA）。但當(dāng)所觀察的熒光標(biāo)本稍厚時(shí)，普通熒光顯微鏡不僅接收焦平面上的光量，而且來自焦平面上方或下方的散射熒光也被物鏡接收，這些來自焦平面以外的熒光使觀察到的圖像反差和分辨率大大降低（即焦平面以外的熒光結(jié)構(gòu)模糊、發(fā)虛，原因是大多數(shù)生物學(xué)標(biāo)本是層次區(qū)別的重

6、疊結(jié)構(gòu)）。一、激光掃描共聚焦顯微鏡的成像基本原理2.共聚焦掃描顯微鏡的成像原理采用點(diǎn)光源照射標(biāo)本，在焦平面上形成一個(gè)輪廓分明的小的光點(diǎn)，該點(diǎn)被照射后發(fā)出的熒光被物鏡收集，并沿原照射光路回送到由雙向色鏡構(gòu)成的分光器。分光器將熒光直接送到探測(cè)器。光源和探測(cè)器前方都各有一個(gè)針孔，分別稱為照明針孔和探測(cè)針孔。兩者的幾何尺寸一致，約100-200nm；相對(duì)于焦平面上的光點(diǎn)，兩者是共軛的，即光點(diǎn)通過一系列的透鏡，最終可同時(shí)聚焦于照明針孔和探測(cè)針孔。這樣，來自焦平面的光，可以會(huì)聚在探測(cè)孔范圍之內(nèi)，而來自焦平面上方

7、或下方的散射光都被擋在探測(cè)孔之外而不能成像。以激光逐點(diǎn)掃描樣品，探測(cè)針孔后的光電倍增管也逐點(diǎn)獲得對(duì)應(yīng)光點(diǎn)的共聚焦圖像，轉(zhuǎn)為數(shù)字信號(hào)傳輸至計(jì)算機(jī)，最終在屏幕上聚合成清晰的整個(gè)焦平面的共聚焦圖像。ConfocalPrinciple每一幅焦平面圖像實(shí)際上是標(biāo)本的光學(xué)橫切面，這個(gè)光學(xué)橫短面總是有一定厚度的，又稱為光學(xué)薄片。由于焦點(diǎn)處的光強(qiáng)遠(yuǎn)大于非焦點(diǎn)處的光強(qiáng)，而且非焦平面光被針孔濾去，因此共聚焦系統(tǒng)的景深近似為零，沿Z軸方向的掃描可以實(shí)現(xiàn)光學(xué)斷層掃描，形成待觀察樣品聚焦光斑處二維的光學(xué)切片。把X-Y平面（焦

8、平面）掃描與Z軸（光軸）掃描相結(jié)合，通過累加連續(xù)層次的二維圖像，經(jīng)過專門的計(jì)算機(jī)軟件處理，可以獲得樣品的三維圖像。觀察方式：以熒光為主光源：激光（紫外、可見光、近紅外）照明方式：點(diǎn)照明、逐點(diǎn)掃描成像方式：共聚焦、逐點(diǎn)成像輸出：實(shí)時(shí)觀測(cè),數(shù)字化圖像，可以進(jìn)行圖像處理和定量分析多重染色樣品的觀察LSCM的基本特點(diǎn)3.共聚焦掃描顯微鏡在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用細(xì)胞結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)（如受體、抗原、抗體、酶、細(xì)胞骨架蛋白等基因表達(dá)產(chǎn)物）、DNA、RNA等細(xì)胞膜流動(dòng)性（熒光光漂白恢復(fù)技術(shù)