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《實驗七、熒光顯微鏡及激光掃描共聚焦顯微鏡使用.pdf》由會員上傳分享,免費在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、實驗七-1細(xì)胞熒光染色觀察與熒光顯微鏡的使用(示范:細(xì)胞形態(tài)觀察與暗視野顯微鏡的使用)實驗?zāi)康呐c教學(xué)要求1.掌握熒光顯微鏡的成像基本原理及其使用;2.掌握暗視野顯微鏡的成像基本原理及其使用。一、熒光顯微鏡的成像原理熒光顯微鏡是一種較為常用的的光學(xué)顯微鏡,其基本原理是利用一定波長的激發(fā)光對樣品進(jìn)行激發(fā),使之產(chǎn)生一定波長的熒光,從而用于對樣品結(jié)構(gòu)或其組分進(jìn)行定性、定位、定量觀察檢測。什么是熒光??物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài),再回到低能狀態(tài)時釋放出的光。?即:物質(zhì)吸收短波光,發(fā)射出的長波光。熒光的性質(zhì)?保持固有的熒光特性?
2、熒光波長>激發(fā)波長?熒光強(qiáng)度極小于激發(fā)光的強(qiáng)度?有不同程度的衰減?熒光強(qiáng)度取決于激發(fā)光強(qiáng)度、被檢物濃度、熒光效率熒光顯微鏡的優(yōu)點和用途優(yōu)點:?檢出能力高?對細(xì)胞的刺激小?能進(jìn)行多重染色用途:?物體構(gòu)造的觀察?熒光的有無、色調(diào)比較進(jìn)行物質(zhì)判別?發(fā)熒光量的測定對物質(zhì)定性、定量分析熒光素的特性熒光素激發(fā)波長發(fā)射波長DAPI372456AMCA350450Hoechst33258365465FITC490520AcridineOrange490590AcridineYellow470550CY3552565TRITC541572Propidium
3、Iodide530615熒光顯微鏡技術(shù)在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用1.對細(xì)胞結(jié)構(gòu)或組分的定性、定位、半定量研究。2.作為生物大分子篩選與鑒定的標(biāo)記物。二、暗視野顯微鏡的成像原理通過特殊的暗視野聚光器,使照明光線改變途徑,不直接進(jìn)入物鏡,而是傾斜地照射到樣品上,由樣品表面的繞射光線入射到物鏡內(nèi),產(chǎn)生樣品的衍射圖象。三、試劑與器材青蛙、洋蔥、人正常肝組織切片和脂肪肝組織切片(HE染色)甲醇、1‰丫啶橙、濾紙、吸管、載玻片熒光顯微鏡、暗視野顯微鏡、普通光學(xué)顯微鏡四、實驗內(nèi)容和實驗步驟1.蛙血細(xì)胞染色觀察:取少許蛙血→常規(guī)血涂片→涼干→甲醇固定10mi
4、n→1‰丫啶橙染色5min→水洗→室溫干燥(濾紙擦干玻片底面)→熒光顯微鏡觀察(先低倍后高倍觀察)(可在同一玻片上觀察未熒光染色的血細(xì)胞)2.取洋蔥→撕取一小片內(nèi)表皮→平面單層鋪展于玻片上→室溫涼干→1‰丫啶橙染色5min→水洗(用吸管,小心掉片)→室溫干燥(或用濾紙擦干)→熒光顯微鏡觀察3.暗視野顯微鏡觀察蛙血細(xì)胞(示范)4.觀察人正常肝組織切片和脂肪肝組織切片(HE染色)五、注意事項1.熒光顯微鏡要在光線盡量暗的環(huán)境下觀察。2.使用熒光顯微鏡時要注意不要直接觀察激發(fā)光源,保護(hù)眼睛。3.暗視野顯微鏡要在光線盡量暗的環(huán)境下觀察。六、作業(yè)與
5、思考題:1.描述在熒光顯微鏡下所觀察到的實驗現(xiàn)象。2.繪圖比較人正常肝組織細(xì)胞和脂肪肝組織細(xì)胞。實驗七-2激光掃描共聚焦顯微鏡在生命科學(xué)中的應(yīng)用實驗?zāi)康呐c要求1.掌握激光掃描共聚焦顯微鏡的成像基本原理及其在生命科學(xué)中的應(yīng)用。LaserScanningConfocalMicroscope一、激光掃描共聚焦顯微鏡的成像基本原理1.普通熒光顯微鏡的不足使用熒光物質(zhì)標(biāo)記細(xì)胞中的特定成分或結(jié)構(gòu),不僅圖像與對比度增強(qiáng),而且由于許多熒光顯微鏡的光源使用短波長的紫外光,大大提高了分辯率(δ=0.61λ/NA)。但當(dāng)所觀察的熒光標(biāo)本稍厚時,普通熒光顯微鏡不
6、僅接收焦平面上的光量,而且來自焦平面上方或下方的散射熒光也被物鏡接收,這些來自焦平面以外的熒光使觀察到的圖像反差和分辨率大大降低(即焦平面以外的熒光結(jié)構(gòu)模糊、發(fā)虛,原因是大多數(shù)生物學(xué)標(biāo)本是層次區(qū)別的重疊結(jié)構(gòu))。2.共聚焦掃描顯微鏡的成像原理采用點光源照射標(biāo)本,在焦平面上形成一個輪廓分明的小的光點,該點被照射后發(fā)出的熒光被物鏡收集,并沿原照射光路回送到由雙向色鏡構(gòu)成的分光器。分光器將熒光直接送到探測器。光源和探測器前方都各有一個針孔,分別稱為照明針孔和探測針孔。兩者的幾何尺寸一致,約100-200nm;相對于焦平面上的光點,兩者是共軛的,即
7、光點通過一系列的透鏡,最終可同時聚焦于照明針孔和探測針孔。這樣,來自焦平面的光,可以會聚在探測孔范圍之內(nèi),而來自焦平面上方或下方的散射光都被擋在探測孔之外而不能成像。以激光逐點掃描樣品,探測針孔后的光電倍增管也逐點獲得對應(yīng)光點的共聚焦圖像,轉(zhuǎn)為數(shù)字信號傳輸至計算機(jī),最終在屏幕上聚合成清晰的整個焦平面的共聚焦圖像。ConfocalPrinciple每一幅焦平面圖像實際上是標(biāo)本的光學(xué)橫切面,這個光學(xué)橫短面總是有一定厚度的,又稱為光學(xué)薄片。由于焦點處的光強(qiáng)遠(yuǎn)大于非焦點處的光強(qiáng),而且非焦平面光被針孔濾去,因此共聚焦系統(tǒng)的景深近似為零,沿Z軸方向的
8、掃描可以實現(xiàn)光學(xué)斷層掃描,形成待觀察樣品聚焦光斑處二維的光學(xué)切片。把X-Y平面(焦平面)掃描與Z軸(光軸)掃描相結(jié)合,通過累加連續(xù)層次的二維圖像,經(jīng)過專門的計算機(jī)軟件處理,可以獲得樣品的三維圖