激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)

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1、激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)ThetechniquesofConfocalLaserScanningMicroscopy基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所王珺激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)基本組成及原理功能熒光探針的選擇樣品要求在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用LaserandelectronicControlUnit激光光源及控制裝置Computer計(jì)算機(jī)Confocalscananddetectorunit共聚焦掃描及檢測(cè)裝置Microscope熒光顯微鏡Anti-vibrationtable防震臺(tái)LaserScaningConfocalSystem激光掃描共聚焦顯微鏡基本

2、配置LaserandelectronicControlUnit激光光源及控制裝置Computer計(jì)算機(jī)Confocalscananddetectorunit共聚焦掃描及檢測(cè)裝置Microscope熒光顯微鏡Anti-vibrationtable防震臺(tái)激光器半導(dǎo)體激光器：405nm氬離子激光器：457nm、477nm、488nm、514nm氦氖綠激光器：543nm氦氖紅激光器：633nm激光掃描共聚焦顯微鏡基本原理檢測(cè)針孔和照明針孔始終聚焦于同一點(diǎn)，使聚焦平面以外被激發(fā)的熒光不能進(jìn)入檢測(cè)針孔?高分辨率的光學(xué)切片激光穿透性強(qiáng)，可對(duì)樣本進(jìn)

3、行一定深度光學(xué)斷層，獲得高標(biāo)準(zhǔn)的連續(xù)光學(xué)切片?實(shí)現(xiàn)三維重建LSCM的基本特點(diǎn)觀察方式：以熒光為主光源：激光（紫外、可見光）照明方式：點(diǎn)照明、逐點(diǎn)掃描成像方式：共聚焦、逐點(diǎn)成像輸出：實(shí)時(shí)觀測(cè),數(shù)字化圖像，可以進(jìn)行圖像處理和定量分析多重染色樣品的觀察基本功能多熒光標(biāo)記樣品的高清晰度、高分辨率圖像采集光學(xué)顯微鏡分辨率：0.25mm共焦顯微鏡分辨率：0.18mm基本功能無損傷、連續(xù)光學(xué)切片，顯微“CT”三維重組confocalconventional基本功能定位、定量分析NucleusHochest33258LysosomeFITCMito

4、chondrionTRITC基本功能時(shí)間序列掃描:xyt、xyzt和xt掃描感興趣區(qū)域掃描基本功能圖像處理功能如對(duì)樣品中很弱或很強(qiáng)的熒光信號(hào)進(jìn)行增強(qiáng)或減弱、去噪、平滑、提取等操作，從而保證了圖像高反差、高清晰度、定位準(zhǔn)確。熒光探針的選擇選擇熒光探針的主要步驟：1、根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康拇_定需要檢測(cè)的目標(biāo)；2、確定可供選擇的熒光探針的范圍；3、考察熒光探針的特性是否符合熒光樣品的制備要求；4、熒光探針與所用共聚焦顯微鏡系統(tǒng)的匹配情況幾種常用的熒光探針DNA和RNA檢測(cè)吖啶橙（AO）、碘化丙啶（PI），既可標(biāo)記DNA又可標(biāo)記RNA。PI不能進(jìn)入完

5、整的細(xì)胞膜，常用于檢測(cè)膜損傷、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞核定位、核酸定量等。激發(fā)波長536nm發(fā)射波長617nm幾種常用的熒光探針AO激發(fā)波長為492nm，發(fā)射波為分別為530/640nm。用激光共聚焦顯微鏡雙通道觀察可見：活細(xì)胞的胞核呈黃綠色熒光，胞質(zhì)呈綠色熒光；死細(xì)胞呈紅色熒光AO492/526DNA強(qiáng)結(jié)合方式綠色熒光492/650RNA弱結(jié)合方式紅色熒光幾種常用的熒光探針Hoechst33342Hoechst33258和DAPI，這三種都是DNA的特異性的熒光染料，細(xì)胞毒性小，特異性強(qiáng)。與DNA結(jié)合后都是以紫外光激發(fā)，發(fā)射明亮的藍(lán)色熒光，

6、分辨率高。幾種常用的熒光探針Hochest33342352/461DNAA-T活細(xì)胞Hochest33258352/461DNAA-T活細(xì)胞DAPI358/461DNAA-T半通透細(xì)胞幾種常用的熒光探針蛋白質(zhì)、酶、抗體及其他分子等的檢測(cè)FITC（異硫氰酸熒光素）能夠結(jié)合細(xì)胞內(nèi)總蛋白質(zhì)，它是檢測(cè)蛋白質(zhì)最常用的熒光探針，它還能廣泛地結(jié)合各種特異性的配體。用488nm的激光器激發(fā)后，發(fā)出明亮的綠色熒光。光照下易淬滅，不易保存。幾種常用的熒光探針另一種常用的共價(jià)標(biāo)記物是羅丹明，其光穩(wěn)定性比FITC好。其衍生物TRITC（四甲基異硫氰基羅丹明

7、）是常用的共價(jià)標(biāo)記探針，發(fā)紅色熒光。幾種常用的熒光探針綠色熒光蛋白（GFP）已成為跟蹤活組織或細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)及蛋白質(zhì)定位的標(biāo)記物。該蛋白吸收光的波長最高峰在395nm處，在479nm處也有吸收峰；發(fā)射的綠色熒光波長最高峰在509nm處，在540nm處伴隨有一小峰。因此內(nèi)源性熒光基團(tuán)受到紫外光或藍(lán)光激發(fā)時(shí)，均可發(fā)出綠色熒光。幾種常用的熒光探針類似于綠色熒光蛋白，目前所使用的熒光蛋白還包括藍(lán)色熒光蛋白（BFP），青色熒光蛋白（CFP）及黃色熒光蛋白(YFP)。幾種常用的熒光探針細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子最常用的有Fluo-3、Fluo-4，能用可

8、見激光（488nm）激發(fā)，發(fā)射峰為525nm，其乙酰甲酯（AM）形式是Fluo-4AM，無熒光，為不帶電荷的親脂化合物，易于滲透脂膜進(jìn)入活細(xì)胞，在胞內(nèi)被非特異酯酶水解，釋放出游離酸形式的熒光探針分子，此游離態(tài)也無熒光，不易漏出胞外，一