激光掃描共聚焦顯微鏡

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1、激光掃描共聚焦顯微鏡（LaserScanningCon-focalMicroscope，LSCM）是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一種新型高精度顯微鏡。它在普通熒光顯微鏡的基礎(chǔ)上加裝激光掃描裝置，使用可激發(fā)的熒光探針，采用敏感的光電倍增管作為檢測器，利用計(jì)算機(jī)控制掃描反射鏡并進(jìn)行圖像采集、處理和分析[1]。激光掃描共聚焦顯微技術(shù)不僅可用于觀察各種固定的細(xì)胞和組織，還可對活細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和離子的變化進(jìn)行實(shí)時動態(tài)觀察和測定[2]。目前，這種技術(shù)已用于細(xì)胞形態(tài)定位、三維結(jié)構(gòu)重建、細(xì)胞內(nèi)離子動態(tài)變化過程等研究，并與定量熒光測定、定量圖像分析等實(shí)用研究手段和技術(shù)相結(jié)合，在形態(tài)學(xué)

2、、生理學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)等分子細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[3]。　　激光掃描共聚焦顯微鏡(confocallaserscanningmi-croscopy,CLSM)是一種新型高精度的激光源加共聚焦顯微鏡,是利用激光作為光源,在傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡基礎(chǔ)上采用共軛聚焦原理和裝置,并利用計(jì)算機(jī)對所觀察分析對象進(jìn)行數(shù)字圖像處理的一套觀察和分析系統(tǒng)其最大特點(diǎn)是對標(biāo)本進(jìn)行無損傷性的實(shí)時觀察分析,得到細(xì)胞或組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)的熒光圖像,以及在亞細(xì)胞水平上觀察諸如Ca2+、pH值、膜電位等生理信號以及細(xì)胞形態(tài)的變化,對生物標(biāo)本進(jìn)行定性、定量、定時和定位研究,具有極大的優(yōu)越性[1]。主要構(gòu)

3、件一個完整的CLSM系統(tǒng)由幾個主要的硬件和一些成像分析軟件組成。硬件包括表面熒光顯微鏡、激光光源及冷卻系統(tǒng)、定位掃描裝置、分辨系統(tǒng)、計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)、顯示器和圖像輸出打印設(shè)備,軟件由三維圖像分析系統(tǒng)和三維圖像文件管理系統(tǒng)構(gòu)成[2]3　主要功能3·1　定性定量定位熒光分析　CLSM可對單、雙或三色標(biāo)記的細(xì)胞及組織標(biāo)本的熒光進(jìn)行定性定量定位分析,還可測定膜電位和配體結(jié)合等生化反應(yīng)程度。此外,還適用于高靈敏度的快速免疫熒光測定,可以準(zhǔn)確檢測抗原表達(dá)、熒光原位雜交斑點(diǎn)及細(xì)胞結(jié)合和殺傷的形態(tài)學(xué)特性并作定量分析,以揭示諸如腫瘤相關(guān)抗原表達(dá)的準(zhǔn)確定位及定量信息[6]。3·2　系列光

4、學(xué)切片及三維圖像重建　共聚焦成像利用光源針孔與檢測針孔共軛這一特性,可有效抑制同一焦平面上非測量點(diǎn)的雜散熒光及來自標(biāo)本中非焦平面的熒光,因而具有深度識別能力及縱向分辨率,可看到較厚生物標(biāo)本的細(xì)節(jié),得到完整活的或固定的細(xì)胞及組織的系列光切片,從而得到各層面的信息,所以也被形象地稱為“顯微CT”。標(biāo)本的各層光學(xué)切片經(jīng)計(jì)算機(jī)圖像處理及三維重建軟件,就可得到三維立體結(jié)構(gòu),從而進(jìn)行各側(cè)面直觀的形態(tài)學(xué)觀察,測定細(xì)胞光學(xué)切片的物理和生物化學(xué)特性的變化,如DNA含量、RNA含量、分子擴(kuò)散和胞內(nèi)離子等,亦可對這些動態(tài)變化進(jìn)行準(zhǔn)確的定性、定量、定時及定位分析[1]。3·3　Ca2+和p

5、H等細(xì)胞內(nèi)離子的實(shí)時定量測定　利用Fluo-3、Fura2等熒光探針,CLSM可以測定Ca2+在活細(xì)胞內(nèi)的濃度變化。CLSM可測定單個或一群細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度,并提供細(xì)胞內(nèi)Ca2+分布的二維及至三維圖像。另外,如果對細(xì)胞施加外部的刺激,CLSM就能觀察到細(xì)胞內(nèi)各點(diǎn)的Ca2+濃度在外部刺激下隨時間而產(chǎn)生的變化[6]。這對于研究Ca2+等離子細(xì)胞內(nèi)動力學(xué)有意義。利用SNAFL類探針可對單個或一群細(xì)胞內(nèi)的pH及細(xì)胞內(nèi)pH的變化進(jìn)行測定。使用雙熒光探針Fluo-3和CNARF可進(jìn)行Ca2+和pH同時測定。3·4　細(xì)胞膜流動性測定　細(xì)胞膜熒光探針受到極化光線激發(fā)后,其發(fā)射光

6、極性依賴于熒光分子的旋轉(zhuǎn),而這種有序的運(yùn)動自由度依賴于熒光分子周圍的膜流動性,因此極性測量可間接反應(yīng)膜的流動性。這種膜流動性測定在膜的磷脂酸組成分析、藥物效應(yīng)和作用位點(diǎn)、溫度反應(yīng)測定和物種比較等方面有重要作用[7]。3.5　細(xì)胞的物理化學(xué)動態(tài)監(jiān)測　CLSM可對細(xì)胞形狀、周長、面積、平均熒光強(qiáng)度及細(xì)胞內(nèi)顆粒數(shù)等參數(shù)進(jìn)行自動測定,能對細(xì)胞的溶酶體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞骨架、結(jié)構(gòu)性蛋白質(zhì)、DNA、RNA、酶和受體分子等細(xì)胞內(nèi)特異結(jié)構(gòu)的含量、組分及分布進(jìn)行定量、定性、定時及定位測定[6]。3.6　光活化技術(shù)　生物體內(nèi)許多重要的活性物質(zhì)和化合物均可形成籠鎖化合物,在處于籠鎖狀

7、態(tài)時,其功能被封閉,而一旦被某特異波長的瞬間光照射后,光活化解籠鎖,使其恢復(fù)原有活性和功能,在細(xì)胞的繁殖、分化等生物代謝過程中發(fā)揮功能。CLSM具有光活化測定功能,可控制籠鎖探針分解的瞬間光波長和照射時間,從而人為控制多種生物活性產(chǎn)物及其他化合物發(fā)揮作用的時間和空間[6]。3.7　細(xì)胞通訊　多細(xì)胞生物體中,細(xì)胞間相互影響和控制的生物學(xué)過程稱為細(xì)胞間通訊,被認(rèn)為在細(xì)胞增殖和分化中起著非常重要的作用。CLSM主要從以下三方面研究胞間通訊:①可從形態(tài)學(xué)上觀察細(xì)胞與細(xì)胞間連接的形態(tài)變化和某些緊密連接的變化,及某些連接蛋白、黏附因子等的變化,從而闡明細(xì)胞間通訊的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)