激光掃描共聚焦顯微鏡操作流程詳解

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1、激光掃描共聚焦顯微鏡(laserscanningconfocalmicroscope)激光掃描共聚焦顯微鏡(laserscanningconfocalmicroscope)，英文簡(jiǎn)寫LSCM，俗稱confocal。LSCM是一種高科技顯微鏡，屬于最先進(jìn)的細(xì)胞生物學(xué)分析儀器。我們學(xué)院使用的是瑞士徠卡公司(Leica)的TCSSP5型號(hào)的LSCM。使用流程1、登陸ftp://10.31.60.139或5號(hào)樓606室公用電腦下載《激光共聚焦預(yù)約使用審核表》，打印并填寫。2、聯(lián)系盧劍清（手機(jī)：13522745991）審核并

2、簽名。3、持已簽名的《激光共聚焦預(yù)約使用審核表》至5號(hào)樓610室預(yù)約使用時(shí)間，及領(lǐng)取鑰匙，聯(lián)系人：竇凱飛（手機(jī)：15210505368）。4、在熟練使用者的指導(dǎo)下，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。5、實(shí)驗(yàn)結(jié)束，及時(shí)歸還鑰匙。儀器構(gòu)造和原理LSCM的基本結(jié)構(gòu)主要包括熒光顯微鏡系統(tǒng)及樣品臺(tái)、激光發(fā)射器、掃描器、檢測(cè)器、圖像存儲(chǔ)處理和輸出設(shè)備、計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)。激光光源：激光掃描束經(jīng)照明針孔形成點(diǎn)光源,普通顯微鏡采用的自然光或燈光是一種場(chǎng)光源,標(biāo)本上每一點(diǎn)的圖像都會(huì)受到鄰近點(diǎn)的衍射光或散射光的干擾。而LSCM以激光為光源,激光具有單色性強(qiáng)﹑方向

3、性好﹑高亮度﹑相干性好等優(yōu)點(diǎn),可以避免普通顯微鏡的缺點(diǎn)。一般常用的氣體激光器如氬(Ar)﹑氪(Kr)﹑氦(He)﹑氖(Ne)。illuminatingpinhole（照明針孔）：使激光經(jīng)過照明針孔后形成點(diǎn)光源，點(diǎn)光源具有光源方向性強(qiáng)、發(fā)散小、亮度高、高度的空間和時(shí)間相干性以及平面偏振激發(fā)等獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。且與detectorpinhole(探測(cè)器針孔)及焦平面形成共聚焦裝置。分光鏡(BeamSplitter)：點(diǎn)光源發(fā)出的光經(jīng)分光鏡反射后,通過物鏡在樣品聚焦。對(duì)標(biāo)本內(nèi)焦平面上的每一點(diǎn)進(jìn)行掃描,Focalplane（焦平

4、面）：激光點(diǎn)光源照射物體在焦平面處聚焦，激發(fā)熒光標(biāo)記的樣本發(fā)射熒光，形成焦點(diǎn)光斑。該光斑經(jīng)過物鏡和分光鏡等一系列裝置的處理，分別在照明針孔及探測(cè)針孔兩處聚焦。共聚焦的含義由此而來。標(biāo)本上的被照射點(diǎn)所發(fā)射的熒光沿同一光路進(jìn)入物鏡,穿過分光鏡后在探測(cè)針孔處成像,該點(diǎn)以外的任何發(fā)射光均被探測(cè)針孔阻擋。然后經(jīng)探測(cè)針孔后的光電倍增管(PMT)或冷電感耦合器件(cCCD)逐點(diǎn)或逐線接收,將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)，傳輸至計(jì)算機(jī)，迅速在屏幕上形成熒光圖像。LSCM是在熒光顯微鏡的基礎(chǔ)上用激光作掃描光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描成像，掃

5、描的激光與熒光收集共用一個(gè)物鏡，物鏡的焦點(diǎn)即掃描激光的聚焦點(diǎn)，也是瞬時(shí)成像的物點(diǎn)。由于激光束的波長較短，光束很細(xì)，所以共聚焦激光掃描顯微鏡有較高的分辨力，大約是普通光學(xué)顯微鏡的3倍。系統(tǒng)經(jīng)一次調(diào)焦，掃描限制在樣品的一個(gè)平面內(nèi)。調(diào)焦深度不一樣時(shí)，就可以獲得樣品不同深度層次的圖像，這些圖像信息都儲(chǔ)于計(jì)算機(jī)內(nèi)，通過計(jì)算機(jī)分析和模擬，就能顯示細(xì)胞樣品的立體結(jié)構(gòu)。儀器用途1、原位鑒定細(xì)胞或組織內(nèi)生物大分子,觀察細(xì)胞及亞細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)：①在細(xì)胞原位檢測(cè)核酸②原位檢測(cè)蛋白質(zhì),抗體及其他分子③檢測(cè)細(xì)胞凋亡④細(xì)胞器觀察及測(cè)定⑤檢測(cè)細(xì)胞

6、融合⑥觀察細(xì)胞骨架⑧檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂肪2、活體細(xì)胞或組織功能的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)：①實(shí)時(shí)定量測(cè)定細(xì)胞內(nèi)Ca2+的變化②測(cè)定細(xì)胞內(nèi)PH變化③檢測(cè)膜電位的變化④檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧物種的產(chǎn)生⑤檢測(cè)藥物等跨膜進(jìn)入組織或細(xì)胞過程及其定位⑥檢測(cè)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)⑦檢測(cè)熒光漂白恢復(fù)(FRAP)樣品制備1．組織切片標(biāo)本實(shí)驗(yàn)標(biāo)本要求單層，并能很好地貼附在樣品池中。所以，組織標(biāo)本無論是石蠟切片還是冰凍切片，均為越薄越好。2．細(xì)胞標(biāo)本細(xì)胞種類和純度，細(xì)胞密度和形態(tài)。3．承載細(xì)胞的器皿Petri皿和玻片。操作步驟一、開機(jī)1.依次打開電腦桌右

7、側(cè)“PCMicroscope”、“ScannerPower”及“LaserPower”三個(gè)圓形按鈕，然后將“LaserPower”按鈕右側(cè)的激光開關(guān)鑰匙（LaserEmission）順時(shí)針旋轉(zhuǎn)90度至“On-1”位置。記錄開機(jī)時(shí)間。2.打開顯微鏡電源，及熒光電源。3.雙擊電腦顯示屏桌面上的“LASAF”圖標(biāo)啟動(dòng)徠卡共聚焦軟件。4.如需使用快掃系統(tǒng)，在“ActivateResonantScanner”選項(xiàng)前打勾。5.點(diǎn)擊“OK”以打開軟件。打開后顯示LASAF基本界面。二、在顯微鏡下觀察樣品1.選擇合適的物鏡，可通過

8、顯微鏡主機(jī)右側(cè)的物鏡轉(zhuǎn)換按鈕，或軟件中的“Objectives”鍵進(jìn)行選擇。2.將樣品置于載物臺(tái)上，在明場(chǎng)條件下選擇合適的視野。通過顯微鏡主機(jī)右側(cè)的按鈕進(jìn)行調(diào)焦，以及顯微鏡主機(jī)左側(cè)的“INT”功能鍵調(diào)節(jié)光強(qiáng)。3.按“TL/IL”功能鍵轉(zhuǎn)換至熒光觀察方法，通過顯微鏡前面板的按鈕選擇合適的熒光濾塊，進(jìn)行樣品的熒光觀察。4.觀察完畢后，按顯微鏡前面板上的熒光“SH