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1、激光掃描共聚焦顯微技術(shù)Laserscanningconfocalmicroscopy激光掃描共焦顯微鏡的設(shè)計(jì)特點(diǎn):1.點(diǎn)照明,具有照明pinhole和探測(cè)pinhole2.照明pinhole和探測(cè)pinhole共軛(共焦),共焦點(diǎn)即被探測(cè)點(diǎn)，被探測(cè)點(diǎn)所在的平面為共焦平面3.具有掃描系統(tǒng)——逐點(diǎn)掃描成像4.激光作為光源5.具有多個(gè)（四個(gè)）熒光通道，可同時(shí)探測(cè)多個(gè)被標(biāo)記物FluorescentMicroscopeObjectiveArcLampEmissionFilterExcitationDiaphragmOcularExcitationFilterObjectiveLase
2、rPinholeExcitationPinholePMTEmissionFilterExcitationFilterConfocalMicroscope人眼分辨率：0.2mm光學(xué)顯微鏡分辨率：0.25mm電子顯微鏡分辨率：0.2nm共焦顯微鏡分辨率：0.18mm電子顯微鏡的缺點(diǎn)：1.由于樣品需要固定,觀測(cè)活細(xì)胞十分困難.2.樣品制備過(guò)程（固定、包埋、切片）造成的假象熒光顯微鏡的缺點(diǎn):1.無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)熒光,透射光的同時(shí)采集,無(wú)法實(shí)現(xiàn)多熒光的同時(shí)采集2.熒光散射光太強(qiáng)，造成實(shí)際分辨率的大大下降。3.熒光漂白很快，使熒光圖像的拍照有困難。4.無(wú)法對(duì)樣品進(jìn)行斷層掃描,完成3D的工作.
3、5.對(duì)于信號(hào)較弱的樣本,無(wú)法提高觀察的靈敏度.6.可以觀查活細(xì)胞或組織但細(xì)胞或組織內(nèi)結(jié)構(gòu)高度重疊激光共聚焦顯微鏡的應(yīng)用單、雙、三,四色標(biāo)記檢測(cè)。精確的一、二、三、四維觀察。高品質(zhì)的熒光成像、透射成像、物體表面反射成像。靜態(tài)和動(dòng)態(tài)觀察(CA2+,pH,膜電位,膜流動(dòng)性等)。定性以及定量分析。光譜掃描,ROI掃描.特殊的光反應(yīng)(FREP,FRAP,CAGED-UNCAGED等)。時(shí)間分辨和快速掃描動(dòng)態(tài)圖像出色的反射光圖像明場(chǎng)，DIC,相差和透射光圖像單標(biāo)，雙標(biāo)和三標(biāo)圖像激光共聚焦顯微成像技術(shù)的應(yīng)用一.定位、定量免疫熒光標(biāo)記（單標(biāo)、雙標(biāo)或三標(biāo)）的定位、定量如：細(xì)胞膜受體或抗原的分
4、布，微絲、微管的分布、兩種或三種蛋白的共存與共定位、蛋白與細(xì)胞器的共定位、干細(xì)胞的分化細(xì)胞凋亡:AnnexinV-fitc+PI末端原位雜交-fitc+PI熒光原位雜交：染色體基因定位單細(xì)胞凝膠電泳GFP的表達(dá)活細(xì)胞或活體組織靜息游離Ca2+的分布與定量活細(xì)胞內(nèi)pH的定量、膜電位的測(cè)量活細(xì)胞內(nèi)自由基水平的定量Helagreen-中心體red-紡錘體Immuno-fluorecencelabel二.光學(xué)切片和三維重組光學(xué)切片和三維重組:LSCM通過(guò)薄層光學(xué)切片功能，可獲得標(biāo)本真正意義上的三維數(shù)據(jù)，經(jīng)計(jì)算機(jī)圖像處理及三維重建軟件，產(chǎn)生生動(dòng)逼真的三維效果，可進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，并揭示
5、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的空間關(guān)系，用以闡明三維結(jié)構(gòu)與組織功能之間的關(guān)系。顯微CT與三維重組3Dreconstruction三.動(dòng)態(tài)測(cè)量游離Ca2+,Mg2+、K+、Na+測(cè)量pH值的檢測(cè)自由基的檢測(cè)相對(duì)測(cè)量程序化測(cè)量：用timelapse中的編程按鈕可進(jìn)行不同時(shí)間序列的掃描測(cè)量?F/F=(F-Fbase)/(Fbase-FBG)四.細(xì)胞膜電位的測(cè)量標(biāo)記膜電位探針(慢反應(yīng)）：JC1510nm530/590nmDioc5(3)548nm573nmDioc6(3)484nm500nm快反應(yīng)探針：Di-4-ANEPPS496nm703nmDi-4-ANEPPS498nm713nm細(xì)胞膜靜息膜電
6、位：-70mV線粒體膜電位：-150mV以上均屬于陽(yáng)離子探針，更容易與線粒體親和，為線粒體膜電位探針FRAP(Fluorescencerecoveryafterphotobleaching)原理IntenselaserBeamBleachesFluorescenceRecoveryoffluorescence10seconds30secondsZerotimeTime%F五.熒光漂白恢復(fù)(FRAP:FluorescenceRecoverafterphotobleaching）熒光光漂白后的回復(fù)：FRAP生物膜脂質(zhì)分子的側(cè)向擴(kuò)散；胞間通訊的研究；胞漿及細(xì)胞器內(nèi)小分子物質(zhì)轉(zhuǎn)移性
7、的觀測(cè)等細(xì)胞骨架構(gòu)成、核膜結(jié)構(gòu)及大分子組裝等。六．熒光能量共振轉(zhuǎn)移(fluorescenceResonanceEnergyTransfer)能量轉(zhuǎn)移：能量從分子的一個(gè)部位向另一個(gè)部位的傳遞，或能量從一個(gè)分子向另一個(gè)分子傳遞。能量的提供者叫能量供體，能量的接受者叫能量受體。熒光能量共振轉(zhuǎn)移的條件兩個(gè)熒光分子：供體-FL1，受體-FL2供體與受體的距離在2-7nm供體的發(fā)射波長(zhǎng)與受體的激發(fā)波長(zhǎng)一致熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）技術(shù)生物大分子結(jié)構(gòu)和功能研究免疫分析核酸雜交分析蛋白質(zhì)間相互作用研究r:分子間距離R0:分子間發(fā)
