激光掃描共聚焦顯微鏡技術講座

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1、激光掃描共聚焦顯微鏡LaserScanningConfocalMicroscope(LSCM)采用激光作為光源，在傳統(tǒng)光學顯微鏡基礎上，使用紫外或可見光激發(fā)熒光探針，采用共軛聚焦原理和裝置，從而得到細胞或組織內(nèi)部微細結構的熒光圖像，在亞細胞水平上觀察生理信號及細胞形態(tài)的變化，并利用計算機對所觀察的對象進行數(shù)字圖象處理的一套集觀察、分析和輸出為一體系統(tǒng)。它把光學成像的分辨率提高了30%~40%，成為形態(tài)學，分子生物學，神經(jīng)科學，藥理學，遺傳學等領域中新一代的研究工具。LSCM的發(fā)展1957年提出了共聚焦顯微鏡技術的某些基本原理，并獲得了美

2、國的專利。1967年成功的應用共聚焦顯微鏡產(chǎn)生了一個光學橫面。1970年牛津和阿姆斯特丹同時向科學界推薦了一種新型的掃描共聚焦顯微鏡。1984年Bio-Rad公司推出了世界第一臺共聚焦顯微鏡品。1987年White和Amos在英國《自然》雜志發(fā)表了“共聚焦顯微鏡時代的到來”一文，標志著LSCM已成為進行科學研究的重要工具。隨后Zeiss、Leica、Meridian等多家公司相繼開發(fā)出不同型號的共聚焦顯微鏡。隨著技術的不斷發(fā)展和完善，產(chǎn)品的性能也不斷改進和更新，應用的范圍也越來越廣泛。Hippocampusneuronsexpressi

3、ngGFPLSCM與普通熒光顯微鏡的圖像質(zhì)量比較熒光顯微鏡LSCM顯微鏡成像清晰度的決定因素:1.分辨率2.球差3.色差1、分辨率：指顯微鏡能將近鄰的兩個質(zhì)點分辨清楚的能力,通常是用顯微鏡所能分辨清楚最近的相鄰兩點間的距離來表示。人眼及各類顯微鏡的分辨率人眼分辨率：0.20mm光學顯微鏡分辨率：0.25mm共焦顯微鏡分辨率：0.18mm電子顯微鏡分辨率：0.20nm2、球差：由主軸上某一物點向光學系統(tǒng)發(fā)出的單色圓錐形光束，經(jīng)該光學系列折射后，不能聚焦成一點,使成像模糊不清,形成一彌散光斑(俗稱模糊圈)，則此光學系統(tǒng)的成像誤差稱為球差。3

4、、色差：由白色物點向光學系統(tǒng)發(fā)出一束白光，經(jīng)該光學系列折射后，組成該束白光的紅、橙、黃、綠、青、藍、紫等各色光，不能會聚于同一點，即白色物點不能結成白色像點，而結成一彩色像斑的成像誤差，稱為色差。LSCM的重要組件激光光源自動顯微鏡掃描模塊（包括共聚焦光路通道和針孔、掃描鏡、檢測器）數(shù)字信號處理器計算機以及圖象輸出設備（顯示器、彩色打印機）等。激光器顯微鏡：物鏡載物臺計算機系統(tǒng)：圖像分析與控制系統(tǒng)激光掃描共聚焦顯微鏡vs熒光顯微鏡激光掃描共聚焦顯微鏡熒光顯微鏡激光掃描共聚焦顯微鏡中常見的激光器激光器Ar激光器:458nm,476nm,4

5、88nm,514nmHeNe:543nm,633nm固體激光器(UV):405nm激光器的特點:1)方向性好:激光基本延直線傳播2)單色性好:??=10-8nm3)高亮度:激光方向性好,其在空間上的能量分布是高度集中的。4)偏振性:激光為平面偏振光,光纖耦合顯微鏡LeicaDMIRBE倒置熒光顯微鏡物鏡LSCM物鏡的重要參數(shù)NA數(shù)值孔徑又叫做鏡口率，簡寫為N.A。是物鏡的主要技術參數(shù)，是判斷物鏡性能高低的重要標志。N.A=n*sina/2n：物體與物鏡間媒質(zhì)的折射率a2：物鏡孔徑角的一半溴萘折射率1.66，香柏油1.515，玻璃1.5

6、2，水的為1.3，空氣為1。香柏油與玻璃折射率相似，故光折射少，透光率高，成像清楚。N.A.越大：放大倍數(shù)越大，分辨率越高，N.A.越大：視場寬度與工作距離越小MagnificationNumericalApertureWorkingDistance(mm)AchromatCorrection4x0.1030.0010x0.256.1020x0.402.1040x0.650.6560x0.800.30100x(oil)1.250.184x20x10x40x60x100x載物臺計算機系統(tǒng)圖像分析與控制系統(tǒng)分析軟件控制軟件+激光共聚焦顯微鏡

7、原理圖1.共聚焦顯微鏡簡化原理圖用于激發(fā)熒光的激光束(Laser)透過入射小孔(lightsourcepinhole)被二向色鏡(Dichroicmirror)反射，通過顯微物鏡(Objectivelens)匯聚后入射于待觀察的標本(specimen)內(nèi)部焦點(focalpoint)處。激光照射所產(chǎn)生的熒光(fluorescencelight)和少量反射激光一起，被物鏡重新收集后送往二向色鏡。其中攜帶圖像信息的熒光由于波長比較長，直接通過二向色鏡并透過出射小孔(Detectionpinhole)到達光電探測器(Detector)（通常是

8、光電倍增管（PMT）或是雪崩光電二極管（APD）），變成電信號后送入計算機。而由于二向色鏡的分光作用，殘余的激光則被二向色鏡反射，不會被探測到。共軛圖2.探測針孔的作用示意圖（解釋了出射小孔所起到的作用）只