激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)

《激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。

1、激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)ThetechniquesofConfocalLaserScanningMicroscopy基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所王珺激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)基本組成及原理功能熒光探針的選擇樣品要求在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用LaserandelectronicControlUnit激光光源及控制裝置Computer計(jì)算機(jī)Confocalscananddetectorunit共聚焦掃描及檢測裝置Microscope熒光顯微鏡Anti-vibrationtable防震臺LaserScaningConfocalSystem激光掃描共聚焦顯微鏡基本

2、配置LaserandelectronicControlUnit激光光源及控制裝置Computer計(jì)算機(jī)Confocalscananddetectorunit共聚焦掃描及檢測裝置Microscope熒光顯微鏡Anti-vibrationtable防震臺激光器半導(dǎo)體激光器：405nm氬離子激光器：457nm、477nm、488nm、514nm氦氖綠激光器：543nm氦氖紅激光器：633nm激光掃描共聚焦顯微鏡基本原理檢測針孔和照明針孔始終聚焦于同一點(diǎn)，使聚焦平面以外被激發(fā)的熒光不能進(jìn)入檢測針孔?高分辨率的光學(xué)切片激光穿透性強(qiáng)，可對樣本進(jìn)

3、行一定深度光學(xué)斷層，獲得高標(biāo)準(zhǔn)的連續(xù)光學(xué)切片?實(shí)現(xiàn)三維重建LSCM的基本特點(diǎn)觀察方式：以熒光為主光源：激光（紫外、可見光）照明方式：點(diǎn)照明、逐點(diǎn)掃描成像方式：共聚焦、逐點(diǎn)成像輸出：實(shí)時(shí)觀測,數(shù)字化圖像，可以進(jìn)行圖像處理和定量分析多重染色樣品的觀察基本功能多熒光標(biāo)記樣品的高清晰度、高分辨率圖像采集光學(xué)顯微鏡分辨率：0.25mm共焦顯微鏡分辨率：0.18mm基本功能無損傷、連續(xù)光學(xué)切片，顯微“CT”三維重組confocalconventional基本功能定位、定量分析NucleusHochest33258LysosomeFITCMito

4、chondrionTRITC基本功能時(shí)間序列掃描:xyt、xyzt和xt掃描感興趣區(qū)域掃描基本功能圖像處理功能如對樣品中很弱或很強(qiáng)的熒光信號進(jìn)行增強(qiáng)或減弱、去噪、平滑、提取等操作，從而保證了圖像高反差、高清晰度、定位準(zhǔn)確。熒光探針的選擇選擇熒光探針的主要步驟：1、根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康拇_定需要檢測的目標(biāo)；2、確定可供選擇的熒光探針的范圍；3、考察熒光探針的特性是否符合熒光樣品的制備要求；4、熒光探針與所用共聚焦顯微鏡系統(tǒng)的匹配情況幾種常用的熒光探針DNA和RNA檢測吖啶橙（AO）、碘化丙啶（PI），既可標(biāo)記DNA又可標(biāo)記RNA。PI不能進(jìn)入完

5、整的細(xì)胞膜，常用于檢測膜損傷、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞核定位、核酸定量等。激發(fā)波長536nm發(fā)射波長617nm幾種常用的熒光探針AO激發(fā)波長為492nm，發(fā)射波為分別為530/640nm。用激光共聚焦顯微鏡雙通道觀察可見：活細(xì)胞的胞核呈黃綠色熒光，胞質(zhì)呈綠色熒光；死細(xì)胞呈紅色熒光AO492/526DNA強(qiáng)結(jié)合方式綠色熒光492/650RNA弱結(jié)合方式紅色熒光幾種常用的熒光探針Hoechst33342Hoechst33258和DAPI，這三種都是DNA的特異性的熒光染料，細(xì)胞毒性小，特異性強(qiáng)。與DNA結(jié)合后都是以紫外光激發(fā)，發(fā)射明亮的藍(lán)色熒光，

6、分辨率高。幾種常用的熒光探針Hochest33342352/461DNAA-T活細(xì)胞Hochest33258352/461DNAA-T活細(xì)胞DAPI358/461DNAA-T半通透細(xì)胞幾種常用的熒光探針蛋白質(zhì)、酶、抗體及其他分子等的檢測FITC（異硫氰酸熒光素）能夠結(jié)合細(xì)胞內(nèi)總蛋白質(zhì)，它是檢測蛋白質(zhì)最常用的熒光探針，它還能廣泛地結(jié)合各種特異性的配體。用488nm的激光器激發(fā)后，發(fā)出明亮的綠色熒光。光照下易淬滅，不易保存。幾種常用的熒光探針另一種常用的共價(jià)標(biāo)記物是羅丹明，其光穩(wěn)定性比FITC好。其衍生物TRITC（四甲基異硫氰基羅丹明

7、）是常用的共價(jià)標(biāo)記探針，發(fā)紅色熒光。幾種常用的熒光探針綠色熒光蛋白（GFP）已成為跟蹤活組織或細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)及蛋白質(zhì)定位的標(biāo)記物。該蛋白吸收光的波長最高峰在395nm處，在479nm處也有吸收峰；發(fā)射的綠色熒光波長最高峰在509nm處，在540nm處伴隨有一小峰。因此內(nèi)源性熒光基團(tuán)受到紫外光或藍(lán)光激發(fā)時(shí)，均可發(fā)出綠色熒光。幾種常用的熒光探針類似于綠色熒光蛋白，目前所使用的熒光蛋白還包括藍(lán)色熒光蛋白（BFP），青色熒光蛋白（CFP）及黃色熒光蛋白(YFP)。幾種常用的熒光探針細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子最常用的有Fluo-3、Fluo-4，能用可

8、見激光（488nm）激發(fā)，發(fā)射峰為525nm，其乙酰甲酯（AM）形式是Fluo-4AM，無熒光，為不帶電荷的親脂化合物，易于滲透脂膜進(jìn)入活細(xì)胞，在胞內(nèi)被非特異酯酶水解，釋放出游離酸形式的熒光探針分子，此游離態(tài)也無熒光，不易漏出胞外，一