《固定化酶》ppt課件

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1、固定化酶深圳大學(xué)吳海強(qiáng)一、概述生物催化劑作用方式示意固定化酶的發(fā)展史什么是固定化酶？水溶性酶水不溶性載體酶自身載體水不溶性酶（固定化酶）固定化技術(shù)化學(xué)偶聯(lián)酶固定化間歇可溶交聯(lián)包埋吸附間歇連續(xù)酶的固定化技術(shù)和固定化酶固定化酶的優(yōu)缺點(diǎn)可重復(fù)使用可以裝塔連續(xù)反應(yīng)優(yōu)點(diǎn)：純化簡(jiǎn)單，易與產(chǎn)物分離提高產(chǎn)物質(zhì)量應(yīng)用范圍廣固定化過(guò)程中酶易失活缺點(diǎn)：首次投入成本高大分子底物較困難二、固定化酶的性質(zhì)及其影響因素（一）固定化酶的性質(zhì)（二）固定化酶性質(zhì)改變的原因（三）評(píng)價(jià)固定化酶的指標(biāo)（四）固定化酶的活力測(cè)定方法（一）固定化酶的性質(zhì)1．固定化對(duì)酶活性的影響：酶活性下降，反應(yīng)速

2、度下降。原因：酶結(jié)構(gòu)的變化空間位阻2．固定化對(duì)酶穩(wěn)定性的影響（1）操作穩(wěn)定性提高；（2）貯存穩(wěn)定性比游離酶大多數(shù)提高；（3）對(duì)熱穩(wěn)定性，大多數(shù)升高，有些反而降低；（4）對(duì)分解酶的穩(wěn)定性提高；（5）對(duì)變性劑的耐受力升高。固定化酶穩(wěn)定性提高的原因：a.固定化后酶分子與載體多點(diǎn)連接。b.抑制自降解，提高了酶穩(wěn)定性。c.酶活力的釋放是緩慢的。3．最適pH的變化pH對(duì)酶活性的影響：（1）改變酶的空間構(gòu)象（2）影響酶的催化基團(tuán)的解離（3）影響酶的結(jié)合基團(tuán)的解離（4）改變底物的解離狀態(tài)，酶與底物不能結(jié)合或結(jié)合后不能生成產(chǎn)物。載體對(duì)固定化酶體系pH的影響載體帶負(fù)電荷

3、，pH向堿性方向移動(dòng)。微環(huán)境是指在固定化酶附近的局部環(huán)境，而把主體溶液稱為宏觀環(huán)境。載體帶正電荷，pH向酸性方向移動(dòng)。產(chǎn)物性質(zhì)對(duì)固定化酶體系pH的影響催化反應(yīng)的產(chǎn)物為酸性時(shí)，固定化酶的pH值比游離酶的pH值高；反之則低4．最適溫度變化一般與游離酶差不多，但有些會(huì)有較明顯的變化。5．底物特異性變化作用于低分子底物的酶特異性沒(méi)有明顯變化既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶特異性往往會(huì)變化。6．米氏常數(shù)Km的變化Km值隨載體性質(zhì)的變化而變化載體與底物帶相同電荷，靜電排斥，固定化酶降低了酶的親和力，Km’>Km。載體與底物電荷相反，靜電吸引，固定化酶

4、增加了酶的親和力，Km‘

5、（克）干固定化酶所具有的酶活力單位?；颍?jiǎn)挝幻娣e（cm2）的酶活力單位表示（酶膜、酶管、酶板）。2.操作半衰期：衡量穩(wěn)定性的指標(biāo)。連續(xù)測(cè)活條件下固定化酶活力下降為最初活力一半所需要的時(shí)間（t1/2）3.4.或稱偶聯(lián)效率，活力保留百分?jǐn)?shù)。5.相對(duì)酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶活力與游離酶活力的比值稱為相對(duì)酶活力（四）固定化酶的活力測(cè)定方法1.振蕩測(cè)定法：2.酶柱測(cè)定法：3.連續(xù)測(cè)定法利用連續(xù)分光光度法等測(cè)定方法可以對(duì)固定化酶反應(yīng)液進(jìn)行連續(xù)測(cè)定，從而測(cè)定固定化酶的酶活力。三、酶固定化技術(shù)微型膠囊法吸附法膠格包埋法共價(jià)交聯(lián)法共價(jià)偶聯(lián)法1、微

6、型膠囊法是將酶包埋在各種高分子聚合物制成的小球內(nèi)，制成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直徑一般只有幾微米至幾百微米，所以也稱為微囊化法。微型膠囊法制備固定化酶有兩種方法①界面沉淀法這是一種簡(jiǎn)單的物理法，它是利用某些高聚物在水相和有機(jī)相的界面上溶解度較低而形成的皮膜將酶包埋。②界面聚合法是用化學(xué)手段制備微囊的方法。利用油水界面上發(fā)生聚合反應(yīng)形成聚合體而將酶包裹起來(lái)。2、吸附法I物理吸附法靜止法電沉積法反應(yīng)器上直接吸附法混合浴或振蕩浴吸附法優(yōu)點(diǎn)：固定化時(shí)酶分子的構(gòu)象很少或基本不發(fā)生變化。缺點(diǎn)：結(jié)合力弱，易解吸附。載體：纖維素、瓊脂糖、活性炭、沸石及硅膠等

7、。II離子結(jié)合法酶分子與含有離子交換基團(tuán)的固相載體相結(jié)合第一個(gè)離子結(jié)合法固定化酶：DEAE—Cellulose固定化過(guò)氧化氫酶第一個(gè)工業(yè)化的固定化酶：DEAE-SephadexA-50固定化氨基?；?、膠格包埋法首先被采用的膠格包埋法是：固定化胰蛋白酶木瓜蛋白酶?－淀粉酶Enzyme+N,N-甲叉雙丙稀酰胺,丙稀酰胺引發(fā)劑－－inactiation將酶或含酶菌體包埋在凝膠細(xì)微網(wǎng)格中，制成一定形狀的固定化酶，稱為網(wǎng)格型包埋法。也稱為凝膠包埋法。4、共價(jià)交聯(lián)法5、共價(jià)偶聯(lián)法可以形成共價(jià)鍵的基團(tuán)：游離氨基，游離羧基，巰基，咪唑基，酚基，羥基，甲硫基，吲哚

8、基，二硫鍵常用載體：天然高分子、人工合成的高聚物、無(wú)機(jī)載體共價(jià)鍵結(jié)合法制備固定化酶的“通式”載體上引進(jìn)活潑基