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1、葉綠體色素的提取分離及其理化性質的觀察2012.3一.實驗目的因此，測定葉綠素含量便成為研究光合作用與氮代謝必不可少的手段，在生產(chǎn)中有著廣泛的應用。1.學習葉綠體色素的提取方法。2.了解葉綠素和類胡蘿卜素的一些主要理化性質。綠色植物的光合作用是在葉綠體色素參與下進行的，了解葉綠體色素的組成、性質及測定對于理解光合作用的本質很有幫助。植物色素包括：①??脂溶性的葉綠體色素：存在于葉綠體，與光合作用有關，如葉綠素、類胡蘿卜素等； ②??水溶性的細胞液色素：存在于液泡中，與花朵的顏色有關，如花青素屬黃酮類物質。二、原理與操作步驟（二）葉綠體色素的提取原理和方法各種植物葉綠體中所含的色素有數(shù)十種，可
2、分三大類。葉綠素類、類胡蘿卜素類和藻色素類（或稱藻膽素類）。后一類只存在于藻類。以下只介紹前兩類。(一).實驗材料：菠菜葉片。葉綠體中含有綠色素（包括葉綠素a和葉綠素b，酯類化合物）和黃色素（包括胡蘿卜素（烴類）葉黃素（衍生的醇類））兩大類。它們與類囊體膜上的蛋白質相結合，而成為色素蛋白復合體，不溶于水，而溶于有機溶劑，故可用乙醇或丙酮等有機溶劑提取。提取的操作步驟：乙醇提取液：（1）取菠菜葉片洗凈、擦干、剪碎、混勻，稱2g，放入研缽中。（2）加入少量石英砂及碳酸鈣粉，加1～2滴管95%乙醇，研磨至糊狀；再加10～15ml95%乙醇，提取1～3min，過濾于三角瓶中；殘渣用5ml95%乙醇沖
3、洗，一同過濾于三角瓶中。提取的操作步驟：水研磨勻槳：另取2g剪碎的新鮮葉片，放入少量石英砂（不加碳酸鈣粉），用水研磨。先加2ml蒸餾水，研至糊狀，再加蒸餾水20ml，攪均，不過濾。為做光破壞準備的乙醇提取液操作步驟：水研磨勻漿操作步驟：因吸附劑（本試驗為濾紙）對不同物質的吸附力不同，當用適當?shù)娜軇┩苿訒r，混合物中各成分在兩相（流動相和固定相）間具有不同的分配系數(shù)，所以它們的移動速度不同，經(jīng)過一定時間層析后，便將混合色素分離。1.提取液中各成分分離：用色層分析的原理加以分離分配系數(shù)吸附脫吸附再吸附再脫吸附葉綠體色素的結構決定極性不同，因而在濾紙上的遷移速率不同。葉綠體色素葉綠素類胡蘿卜素葉綠素
4、a葉綠素b胡蘿卜素葉黃素葉綠素的化學結構細菌葉綠素a葉綠素a葉綠素b卟啉植醇葉綠醇烴類衍生的醇類吸附劑：濾紙推動劑：石油醚:丙酮:苯（10:2:1）步驟：（1）圓形定性濾紙1張（直徑11cm），用細頭的吸管在其中心戳一圓形小孔（直徑約3mm）。（2）另取一張濾紙條（5cm×1.5cm），沿紙條長度方向涂色素，限制在0.5cm，風干后，重復涂抹數(shù)次。沿長度方向卷成紙捻。涂抹色素要適量，量多拖尾，量少色帶看不清。涂抹色素的技巧方法：將色素放到一塊平板玻璃上，涂抹紙片，這樣涂抹的色帶窄，分離效果好。（3）紙捻帶有色素的一端插入圓形濾紙的小孔中，與濾紙平齊（勿凸出）。（4）康維皿放置培養(yǎng)皿內，康維皿
5、中央小室中加滿推動劑。（5）把帶有紙捻的圓形濾紙平放在康維皿上，使紙捻下端浸入推動劑中。蓋好培養(yǎng)皿(為什么？)。（6）推動劑到達濾紙邊緣時，取出濾紙，風干。用鉛筆標出各種色素的位置和名稱。（7）剪下一部分附到實驗報告中。注意：1、色素多涂抹幾次，風干后再涂抹第二次。細，勻，直，濃。2、涂抹的色素要適量，量多易發(fā)生拖尾，量少色帶看不清；3、紙捻卷緊；4、色素涂抹的寬度不要超過紙條的二分之一；5、中心孔要小而圓；平齊，勿突出；6、分離時一定要蓋嚴，防止推動劑蒸發(fā)。顏色從外往內分別是橙黃色、黃色、藍綠色和黃綠色。分別為：？實驗結果：標出各種色素名稱（1）.光對葉綠素的破壞作用葉綠素（a，b）的化學
6、性質很不穩(wěn)定，容易受強光的破壞，特別是當葉綠素與蛋白質分離以后，破壞更快，而類胡蘿卜素則較穩(wěn)定。（提取出葉綠素后先做這一步）用15N研究燕麥葉片中色素的合成和分解發(fā)現(xiàn)，72小時全部更新一遍。2.葉綠體色素的理化性質光對葉綠素破壞的操作步驟：稀釋時不用嚴格定量？稀釋2-3倍，為什么要稀釋？水提取液暗光乙醇提取液暗光注意：色素乙醇提取液的濃度太大，必須進行稀釋才能做光破壞實驗，稀釋倍數(shù)視提取液的濃度確定，濃度不要過大，否則在短時間之內效果不明顯。光下破壞的時間不要過長，否則看不到效果。陰天可以適當延長，時刻觀察。陰天和晚上上課的同學取濾紙一張，將兩種液分別涂抹在濾紙上，帶回去，放在光下處理。水研
7、磨勻漿液乙醇提取液置于光下10分鐘折疊剪開置于暗處（2）、熒光現(xiàn)象葉綠素的熒光:葉綠素酒精溶液在透射光下為翠綠色，在反射光下為棕紅色。這紅光就是葉綠素受光激發(fā)后發(fā)射的熒光。葉綠素酒精溶液的熒光強度較強，約達其吸收光的10％左右，而鮮葉的熒光強度較低，只占其吸收光的0.l～1％。當熒光出現(xiàn)后，立即中斷光源，用靈敏的光學儀器還可在短時間內看到紅色“余暉”，這是磷光。如果提取液的濃度較低，無法觀察到熒光。葉綠素的熒
