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《基因表達譜分析技術(shù)_3190》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、基因表達譜分析技術(shù)1微陣列技術(shù)(microarray)這是近年來發(fā)展起來的可用于人規(guī)?？焖贆z測基因差別表達、基因纟fl表達譜、DNA序列多態(tài)性、致病基因或疾病相關(guān)基因的一項新的基因功能研究技術(shù)。其原理基本是利用光導(dǎo)化學(xué)合成、照相平板卬刷以及固相表面化學(xué)合成等技術(shù)，在固相表面合成成千上萬個寡核昔酸“探針”(cDNA.ESTs或基因特界的寡核背酸)，并與放射性同位素或熒光物標記的來自不同細胞、組織或整個器官的DNA或mRXA反轉(zhuǎn)錄牛成的笫一鏈cDNA進行雜交，然后用特殊的檢測系統(tǒng)對每個雜交點進行定量分析。其優(yōu)點是可以同時對人雖基因，共至整個基因纟fl的基因表達進行對比分析。包括cDNA芯片(cD
2、NAmicroarray)和DNA芯片(DNAchips)。cDNA芯片使用的載體可以是尼龍膜，也nJ以是玻片。當(dāng)便用尼龍膜吋，目前的技術(shù)水平可以將20000份材料點在一張12cmX18cm的膜上。尼龍膜上所點的一般是編好順序的變性了的雙鏈cDNA片段。要得到基因表達情況的數(shù)據(jù)，只需要將未知的樣品與其雜交即可。雜交的結(jié)果表示這一樣詁中基因的表達模式，而比較兩份不同樣站的朵交結(jié)果就可以得到在不同樣品中表達模式存在差異的基因。雜交使用的探針一般為mRNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，標記探針使用32PdATP。如果使用玻片為載體，點陣的密度要高于尼龍膜。雜交時使用兩種不同顏色的熒光標記不同的兩份樣品，然后將兩份
3、樣品混合起來與一張芯片雜交。洗去未雜交的探針以后，能夠結(jié)合標記cDNA的點受到激發(fā)后會發(fā)出熒光。通過掃描裝置對以檢測各個點發(fā)出熒光的強度。對每一個點而言，所發(fā)出的兩種不同熒光的強度的比值，就代表它在不同樣品屮的豐度。一般來講，顯示出來的圖像中，黃色的點表示在不同的樣品中豐度的差異不大，紅色和綠色的點代表在不同樣品中其豐度各不相同。便用尼龍膜為載體制作cDNA芯片進行研究的費用要比玻片低，因為尼龍膜可以重復(fù)雜交。檢測兩種不同的組織或和同組織在不同條件卞基因表達的差界，只需要使用少量的尼龍膜。但是利用玻片制作的cDNA芯片靈敏度更高，
4、仏幾可以使用2種探創(chuàng)?同時與芯片雜交，從而降低了因為雜交操作
5、帶來的差異；缺點是無法重復(fù)使用還必須使用更為復(fù)雜的儀器。Guo等(2004)將包含104個重組子的cDNA文庫點在芯片上，用丁?檢測擬南芥葉片衰老時的基因表達模式，得到大約6200差異表達的ESTs,對應(yīng)2491個非重復(fù)基因。其中冇134個基因編碼轉(zhuǎn)錄因子，182個基因預(yù)測參與信號傳導(dǎo)，如MAPK級聯(lián)傳導(dǎo)路徑。Li等(2006)設(shè)計髙密度的寡核甘酸t(yī)ilingmicroarray方法，檢測釉稻全基因組轉(zhuǎn)錄表達況。芯片上包含13,07&888個36-mer寡核昔酸探針,基于釉稻全基因組shot-gun測序的序列合成，大約81.9%(35,970)的基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄事件。Hu等(2006)用含有60
6、,000寡核昔酸探針(代表水稻全部預(yù)測表達基因)的芯片檢測抗旱轉(zhuǎn)基因植株(過量表達SNAC1水稻)中基因的表達情況，揭示人量的逆境相關(guān)基因都是上升表達的。2基因表達系列分析(Serialanalysisofgeneexpression,SAGE)基因表達系列分析(SAGE)是一種轉(zhuǎn)錄物水平上研究細胞或組織基因表達模式的快速、冇效的技術(shù)，也是一?種高通最的功能基因組研究方法，它可以同時將不同基因的表達情況進行最化研究(Velculescuetal.,1995)。SAGE的基本原理是：每一條mRA序列都可以用它包含的9bp的小片段(TAG)代替，因此考查這些TAGs出現(xiàn)的頻率就能知道每一種mR
7、NA的豐度。首先利用生物素標記的oligo(dT)引物將mRNA反轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA,然后利用Nlalll酶切雙鏈cDNA。Nlalll酶的識別位點只有4bp,因此cDNA都被切成兒十bp的小片段。帶有生物素標記的小片段cDNA被分離出來，平均分成2份。這2份cDNA分別跟2個接頭連接，2個接頭中均有一個FokT酶切位點。FokT是一種ITS型核酸內(nèi)切酶，其識別位點不對稱，切割位點位于識別位點下游9bp且不依賴于特異的DNA序列。l；okl酶切分成2份的cDNA之后，帶冇部分接頭序列的TAGS就被釋放下來。這時將2份cDNA混合起來，進行連接反應(yīng)。根據(jù)接頭序列設(shè)計引物擴增連接反應(yīng)的產(chǎn)物，然后
8、通過NlaTTT酶切PCR產(chǎn)物得到連接在一起的兩個TAG,即ditago將ditags串連起來，克隆到質(zhì)粒載體中。一般每個克隆包含50個左右的ditagso這些克隆經(jīng)過PCR擴增然后測序。因為每一個ditagZ間都是以Nlalll識別位點間隔的，所以很容易對每個的ditag進行區(qū)分和計數(shù)。而每一個TAG在SAGE庫中出現(xiàn)的頻率就代表了該基因的表達水平。利用SAGE可以在短期內(nèi)得到豐富的衣達信息，與直接測定cD
