細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)簡(jiǎn)介

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1、細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)簡(jiǎn)介轉(zhuǎn)染，是將外源性基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)的一種專門技術(shù)。隨著基因與蛋門功能研究的深入，轉(zhuǎn)染H前已成為實(shí)驗(yàn)室丄作中經(jīng)常涉及的基本方法。轉(zhuǎn)染大致對(duì)分為物理介導(dǎo)、化學(xué)介導(dǎo)和生物介導(dǎo)三類途徑。電穿孔法、顯微注射和基因槍屬于通過(guò)物理方法將基因?qū)爰?xì)胞的范例；化學(xué)介導(dǎo)方法很多，如經(jīng)典的磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法、和多種陽(yáng)離了物質(zhì)介導(dǎo)的技術(shù)；化物介導(dǎo)方法，有較為原始的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染，和現(xiàn)在比較多見的各種病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)。理想細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法，丿應(yīng)該具有轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性小等優(yōu)點(diǎn)。病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)，是目前轉(zhuǎn)染效率垠高的方法，同時(shí)具冇細(xì)胞毒性很低的優(yōu)勢(shì)。但是，病毒轉(zhuǎn)染方

2、法的準(zhǔn)備程序復(fù)雜，常常對(duì)細(xì)胞類型有很強(qiáng)的選擇性，在?般實(shí)驗(yàn)室屮很難普及。其它物理和化學(xué)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法，則各有其特點(diǎn)。木公司&產(chǎn)的高效轉(zhuǎn)染試劑VigoFect,是-?種以陽(yáng)離子非脂性物質(zhì)為主的配方組分，該類物質(zhì)介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染，是H前非病毒轉(zhuǎn)染方法中轉(zhuǎn)染效率最高的方法。VigoFect使用方便，轉(zhuǎn)染效率高，對(duì)細(xì)胞毒性小，并白廣譜的轉(zhuǎn)染特性。在許多實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期使用，獲得了優(yōu)異的效果。一些實(shí)驗(yàn)室用VigoFect進(jìn)行SRNA的轉(zhuǎn)染，也獲得滿意的結(jié)果。需要指出的一點(diǎn)，無(wú)論采用哪種轉(zhuǎn)染技術(shù)，要獲得最優(yōu)的轉(zhuǎn)染結(jié)果，可能都需要對(duì)轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行優(yōu)化。影響轉(zhuǎn)染效率的因索很多，從細(xì)胞類型

3、、細(xì)胞培養(yǎng)條件和細(xì)胞生氏狀態(tài)，到轉(zhuǎn)染方法的操作細(xì)節(jié)，都需要考慮。細(xì)胞傳代(1)試驗(yàn)準(zhǔn)備：200ul/1mlTip頭各盒(以上物品均需高壓滅菌)，酒精棉球，廢液缸，試管架，微量移液器，記號(hào)筆，培養(yǎng)皿，離心管。⑵棄掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用1ml的PBS溶液洗滌兩次。⑶用Tip頭加入1mlTrypsin液，消化1分鐘(37。C,5%CO2)。川手輕拍培養(yǎng)瓶壁，觀察到細(xì)胞完全從壁上脫落下來(lái)為止。(4)加入1ml的含血清培養(yǎng)基終止反應(yīng)。(5)用Tip頭多次吹吸，使細(xì)胞完全分散開。(6)將培養(yǎng)液裝入離心管中，1000rpm離心5min0(7)用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后選擇0

4、.8X106個(gè)細(xì)胞加入一個(gè)35mm培養(yǎng)皿。(8)將合適體積完全培養(yǎng)液加入離心管中，混勻細(xì)胞后輕輕加入培養(yǎng)皿中，使其均勻分布。(9)將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)入002培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第二天轉(zhuǎn)染。細(xì)胞轉(zhuǎn)染1)轉(zhuǎn)染試劑的準(zhǔn)備A.將400ul去核酸酶水加入管中，震蕩10秒鐘，溶解脂狀物。B.震蕩后將試劑放在一20攝氏度保存，使用前述需震蕩，。2)選擇合適的混合比例(1：1-1：2/脂質(zhì)體體積：DNA質(zhì)量)來(lái)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在個(gè)轉(zhuǎn)染管中加入合適體積的無(wú)血清培養(yǎng)基。加入合適質(zhì)量的MyoD或者EGFP的DNA,震蕩后在加入合適體積的轉(zhuǎn)染試劑，再次震蕩。5）將混合液在室溫放置10—15分鐘。6）吸去培

5、養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用PBS或者無(wú)血清培養(yǎng)基清洗一次。7）加入混合液，將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個(gè)小時(shí)。8）到時(shí)示，根據(jù)細(xì)胞種類決定是否移除混合液，之示加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)。笫二次細(xì)胞傳代1）在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果并記錄綠色熒光蛋白表達(dá)情況。2）再次進(jìn)行細(xì)胞傳代，按照免疫染色介適的密度0.8X105個(gè)細(xì)胞/35mm培養(yǎng)皿將細(xì)胞重新粉入培養(yǎng)皿中。3）在正常條件下培養(yǎng)24小時(shí)后按照染色要求條件固定。轉(zhuǎn)染技術(shù)的選擇對(duì)轉(zhuǎn)染結(jié)果影響也很大，許多轉(zhuǎn)染方法需要優(yōu)化DNA與轉(zhuǎn)染試劑比例，細(xì)胞數(shù)量，培養(yǎng)及檢測(cè)時(shí)間等。一些傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染技術(shù)，如DEAE右旋糖卄法，磷酸

6、鈣法，電穿孔法，脂質(zhì)體法各有利弊，其主要原理及應(yīng)用特點(diǎn)見下表：轉(zhuǎn)染方法原理應(yīng)用特點(diǎn)磷酸鈣法磷酸鈣DNA復(fù)合物吸附細(xì)胞膜被細(xì)胞內(nèi)吞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染不適用于原代細(xì)胞操作簡(jiǎn)便但重復(fù)性差有些細(xì)胞不適用DEAE?右旋糖營(yíng)法帶止電的DEAE-右旋糖苗打核酸帶負(fù)電的磷酸骨架相互作川形成的復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染相對(duì)簡(jiǎn)便、結(jié)果可重復(fù)但對(duì)細(xì)胞有一定的毒副作用轉(zhuǎn)染時(shí)需除血清電穿孔法高脈沖電壓破壞細(xì)胞膜電位，DNA通過(guò)膜上形成的小孔導(dǎo)入穩(wěn)定轉(zhuǎn)染瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染所有細(xì)胞適用性廣但細(xì)胞致死率高，DNA和細(xì)胞用量人，需根據(jù)不同細(xì)胞類型優(yōu)化電穿孔實(shí)驗(yàn)條件病簿介導(dǎo)法通過(guò)侵染宿主細(xì)胞將外源基因整介

7、到染色體中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、原代細(xì)胞,體內(nèi)細(xì)胞等逆轉(zhuǎn)錄病毒特定宿主細(xì)胞但攜帶基因不能太大細(xì)胞需處分裂期需考慮安全因素腺病毒通過(guò)侵染宿主細(xì)胞將外源基因整介到染色體屮瞬時(shí)轉(zhuǎn)染特定宿主細(xì)胞可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞需考慮安全因素陽(yáng)離子脂質(zhì)體法帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染所有?細(xì)胞適用性廣，轉(zhuǎn)染效率高，重復(fù)性好，但轉(zhuǎn)染時(shí)需除血清。轉(zhuǎn)染效果隨細(xì)胞類型變化大Biolistic顆粒傳遞法將DNA用顯微匝金屬顆粒沉淀，再將包被好的顆粒用彈道裝置投射入細(xì)胞，DNA在胞內(nèi)逐步禪放，表達(dá)瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染可用于：人的表皮細(xì)胞，纖維原細(xì)胞，淋巴細(xì)

8、胞系以及原代細(xì)胞顯微注射