毒死蜱降解菌的篩選鑒定.doc

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1、第4章毒死脾降解菌的篩選鑒定4.1毒死蟬簡(jiǎn)介毒死脾(chlorpyrifos),有效成分的化學(xué)名稱為0,0■二乙基-0-(3,5,6-三氯毗喘基)硫逐磷酸酯，是美國(guó)陶氏化學(xué)公司(DowChemicalCo.)于1965年開(kāi)發(fā)并研制出來(lái)的一種廣譜性有機(jī)磷酸酯類殺蟲(chóng)劑，作為衛(wèi)生殺山劑，可以用來(lái)防治白蟻、虱子、跳蚤和蟬螂等多種衛(wèi)生害蟲(chóng)［83］；作為農(nóng)用殺蟲(chóng)劑，可有效防治水稻、蘋果、蔬菜等丄的盼蟲(chóng)、嘀類、小菜蛾等百余種害蟲(chóng)［841o值得注意的是，毒死脾潛在危險(xiǎn)性不容忽視，對(duì)魚(yú)類及水生生物毒性較高［85］

2、,對(duì)蚯蚓不安全，能夠明顯加重蚯蚓的死亡率［86］o2000年6月8H美國(guó)環(huán)境保護(hù)局官員Browner指出,毒死蟬殺蟲(chóng)劑對(duì)人的神經(jīng)系統(tǒng)和腦發(fā)育可能會(huì)有潛在影響，對(duì)兒童健康有害［87］。許多國(guó)家對(duì)農(nóng)產(chǎn)品，特別是蔬菜丄的毒死脾殘留量進(jìn)行了嚴(yán)格的規(guī)定。在對(duì)外貿(mào)易小農(nóng)藥殘留檢測(cè)項(xiàng)H屮也包括毒死蟬。因此，毒死蟬的殘留問(wèn)題H益受到重視。4.1.1高效降解菌株的篩選4丄1?1微生物的獲取途徑H前，可降解農(nóng)藥的微生物的獲得途徑主耍有：從受農(nóng)藥污染嚴(yán)重的土壤屮篩選分離具優(yōu)良性狀的菌種；定向培育優(yōu)良菌種；在此基礎(chǔ)上，

3、進(jìn)行誘變育種及構(gòu)建工程菌。從受農(nóng)藥污染嚴(yán)重的土壤屮篩選分離具優(yōu)良性狀的菌種是H前采用最多的一種方法，一般是利用農(nóng)藥排污口及周圍或長(zhǎng)期使用某一種農(nóng)藥的土壤，經(jīng)富集培養(yǎng)，分離出可降解農(nóng)藥的高效菌株。定向培育優(yōu)良菌種近年來(lái)也受到人們的關(guān)注，其方法就是在土壤川通過(guò)人為多次施藥，培育可降解該農(nóng)藥的微生物，半再次施藥時(shí)，經(jīng)降解速率的測(cè)定，如發(fā)現(xiàn)農(nóng)藥在該土壤屮的降解速度快于未施藥土壤，則可確定可降解該種農(nóng)藥的微生物種群己被培育起來(lái)，而后從屮分離出高效菌株。這方而的研究已有過(guò)成功的例子,如Alian等通過(guò)向土壤

4、施用蔡內(nèi)酸草胺誘發(fā)該農(nóng)藥降解菌的產(chǎn)生并分離。Ronald等連續(xù)向土壤施用乙烯菌核利，誘發(fā)篩選出該農(nóng)藥的降解菌假單抱桿菌。在上述農(nóng)藥降解菌的培育過(guò)程屮，誘變育種也是常用的方法。王永杰等通過(guò)紫外誘變育種獲得高效菌株，劉玉煥等用NTG誘變曲霉屬樂(lè)果降解菌，用該菌處理樂(lè)果1小時(shí)后，樂(lè)果降解率由原來(lái)的56%提高到87%o4.1.1.2微生物菌種的篩選步驟在自然界，微生物是以混雜的形式群居于一起的，菌株篩選是以純種培養(yǎng)為基礎(chǔ)的，要根據(jù)菌種的特性、嗜好、形態(tài)丄的差異，運(yùn)用靈活的手段才能將所需要的微生物分離出來(lái)

5、，一般的篩選步驟是：采樣、富集培養(yǎng)、純種分離、篩選、鑒定。(1)采樣為獲取降解農(nóng)藥的微生物菌株，可從現(xiàn)己收藏的菌種小篩選，亦可以從土壤、水體或污染環(huán)境屮采樣經(jīng)直接分離篩選或經(jīng)富集培養(yǎng)獲得。土壤長(zhǎng)期使用某一?農(nóng)藥使得該農(nóng)藥降解菌逐漸富集，以后施入該農(nóng)藥時(shí)，其分解速率大大加快，這也是一些除草劑連續(xù)施用后效果下降的原因，如直接分離得不到H的微生物，可能是該微生物在試樣屮不存在或含量太少，遇到這種情況也可采用富集培養(yǎng)。（2）富集培養(yǎng)采來(lái)的樣品屮往往是我們想要的菌類含量不大，血另一些微生物卻大量存在，為了

6、容易分離到所需要的菌種，血讓無(wú)關(guān)的微生物至少是數(shù)量上不要增加，可以選擇性地配置培養(yǎng)基，選擇一定的排樣條件來(lái)控制，例如碳源的控制等。農(nóng)藥降解菌的富集培養(yǎng)方法主要有：液體培養(yǎng)法、土壤環(huán)流法、連續(xù)流動(dòng)培養(yǎng)法。通常是從長(zhǎng)期被某種藥劑污染的土壤和污水屮取樣經(jīng)富集培養(yǎng)，再經(jīng)固體培養(yǎng)分離純化得到所需菌株。根據(jù)Veldkamp的研究，富集培養(yǎng)可分為封閉式和開(kāi)放式（即連續(xù)培養(yǎng)）兩種類型。恒化器作為連續(xù)培養(yǎng)是一種有效方法，以H標(biāo)農(nóng)藥作為培養(yǎng)屮的生長(zhǎng)限制底物，在這種選擇原則的作用下，可篩選到降解H標(biāo)農(nóng)藥的微生物菌株或

7、誘發(fā)出有降解能力的突變菌株。由于農(nóng)藥具有成本低、見(jiàn)效快、省吋省力等優(yōu)點(diǎn)，在世界各國(guó)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)屮被廣泛生產(chǎn)使用，僅同吋借助恒化器也可進(jìn)行分子育種，如Kelloge曾在恒化器屮接入各種有關(guān)農(nóng)藥降解的質(zhì)粒菌，逐漸增加2,4,5?T的濃度進(jìn)行誘導(dǎo)，結(jié)果培養(yǎng)出能降解除草劑2,4,5-T的工程菌,使難以被微生物降解的高殘留除草劑有了“克星”?？梢?jiàn)富集培養(yǎng)對(duì)農(nóng)藥降解菌的分離篩選起著重要作用[35]o（3）菌株的分離和篩選農(nóng)藥降解微生物的分離、篩選是根據(jù)微生物對(duì)環(huán)境因子的耐受范圍具有可塑性，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物可利用性比較

8、廣泛的特性，在選擇性培養(yǎng)基屮加入某些特殊碳源為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使樣品屮少數(shù)能分解利用此類物質(zhì)的微生物大量繁殖，并將其分離出來(lái)的方法。純種分離的方法一?般采用混合平板分離法、平板劃線分離法、涂抹法或稀釋分離法。要根據(jù)各類微生物生長(zhǎng)所需要的營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境條件不同血人為地加以控制，有利于某種微生物在培養(yǎng)基上出現(xiàn)典型單個(gè)菌落。4.2實(shí)驗(yàn)部分4.2.1材料及儀器4.2.1.1菌種來(lái)源菌種來(lái)自巢湖某農(nóng)藥廠排污溝污泥，取回后用保鮮袋帶回，并在4°C下保存。4.2.1.2標(biāo)準(zhǔn)試劑與藥品二氯甲烷（Dichlorometha