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《骨髓間充質(zhì)干細胞的轉(zhuǎn)染.doc》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、第一大腸桿菌感受態(tài)的制備轉(zhuǎn)化是將外源DNA分子引入另一細胞品系，使受體細胞獲得新的遺傳形狀的一種手段。受體細胞經(jīng)過一些特殊方法的處理后，細胞膜的通透性發(fā)生了暫時性的改變，成為能容許外源DNA分子進入的感受態(tài)細胞。一，實驗材料：1，LB液體培養(yǎng)基：稱取蛋白胨10g,酵母提取物5g,氯化鈉10g,溶于800ml去離子水中，用NaOH調(diào)節(jié)PH到7.5，加去離子水定容至1L,高壓滅菌20min.2，LB平板培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基中按1.5%的濃度加入瓊脂，加熱溶解，進行高壓滅菌。取出后趁熱在無菌條件下，倒入無菌的平皿中，每套平皿中加入12-15ml，凝固后倒置，
2、4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?，0.1mol/lCaCL2溶液：稱取1.1g五水CaCL2用雙蒸水溶解，定容到100ml.高壓滅菌20min.二，實驗步驟：1，從LB平板上挑取新活化的大腸桿菌單個菌落，接種到3-5mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)12h左右，直至對數(shù)生長期，然后將該菌液以1：100(1：50)接種到100mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)2-3h至OD600nm=0.52，培養(yǎng)液在冰上冷卻10min,轉(zhuǎn)入離心管中，4℃下，4000r/min離心10min.3,棄去上清液，用預(yù)冷的0.1mol/lCaCL2溶液輕輕懸浮細胞，冰上放置15-30m
3、in.4,4℃下，4000r/min離心10min.5,棄去上清液，加入300μl預(yù)冷的0.1mol/lCaCL2溶液，輕輕懸浮細胞，冰上放置幾分鐘，即制成感受態(tài)細胞懸液。6，以上制備好的細胞懸液可在冰上放置，24h內(nèi)用于轉(zhuǎn)化實驗，或添加冷凍保護劑（15-20%）后超低溫-70℃冷凍貯存。第二，將帶有目的基因的載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌中。1，取200μl感受態(tài)細胞懸液（若是冷凍保存液，冰浴中使其解凍，解凍后立即進行下面操作）加入載體質(zhì)粒溶液（含量不超過50ng,體積不超過2μl）.2，將含有混合液的離心管輕輕搖勻，冰上放置30min后，42℃水浴中熱
4、沖擊2min,然后迅速置于冰上冷卻3-5min.3，向各管中加入100μlLB液體培養(yǎng)基，使總體積約為0.2ml,即制備成轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液，混勻后37℃溫浴15min以上，震蕩培養(yǎng)。此時細菌回復(fù)正常生長狀態(tài)，并使轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生抗藥性。第三，質(zhì)粒菌落的準備1，LB培養(yǎng)基的配制：稱取胰化蛋白胨10g,酵母提取物5g,氯化鈉10g.加入適量去離子水搖動容器至容器溶解，然后用5M(mol/l)氫氧化鈉調(diào)節(jié)ph到7.0，然后用去離子水定容到1L,待上述溶液完全溶解后，向另一廣口瓶中加入瓊脂粉，每100mlLB培養(yǎng)基加入1.5g瓊脂粉。進行高壓滅菌后，將融化的LB固體培養(yǎng)基
5、在55℃水浴中，待培養(yǎng)基溫度將至55℃即授課觸摸，加入抗生素，每100mlLB培養(yǎng)基中加入1ml100mg/ml的卡那霉素（1g/1000ml），充分搖勻。2，LB培養(yǎng)板制作：將加入抗生素的LB培養(yǎng)基充分搖勻后倒入90x25mm2皿中10-20mlLB,倒板后打開蓋子半蓋狀態(tài)，在紫外燈下10-15min.最后封口，4℃保存。3，劃板接種菌：用接種環(huán)取新鮮培養(yǎng)的菌落或甘油菌液，劃板接種到卡那霉素（千分之一）的LB平板上，37℃溫箱孵育16-18h(一般12h開始生長菌落，時間以菌落生長狀態(tài)判斷。)，將平板應(yīng)該反放，注意不可讓菌落長太大。4，搖菌：（1）首先
6、將卡那霉素2ml,解凍，然后加于200ml高壓滅菌后的LB液體培養(yǎng)基中，搖勻，然后用5ml移液槍分裝兩個10ml離心管，每管5ml含卡那霉素的LB培養(yǎng)基。然后立即對LB液體培養(yǎng)基的容量瓶封口，并酒精擦拭火焰消毒。在使用5ml移液器過程中，槍頭不可碰到容量瓶或離心管壁。（2）其次，用10微升或0.5-1微升的搶吸取培養(yǎng)板上的單個菌落，然后將槍頭在10ml離心管中晃動數(shù)次，將槍頭打入10ml離心管中。（3）最后，對10ml離心管封口，用記號筆記下操作時間，操作質(zhì)粒菌的名稱，順序。（如：2011，8，17a/bs3）（4）將接種取完的菌板封閉放于4℃，將含有卡
7、那霉素的LB培養(yǎng)基放于4℃，將10ml離心管管口封閉好，用報紙包扎放于塑料泡沫中，放入搖床，37攝氏度，200r,搖16-18h(目的是使細菌快速生長，并表達質(zhì)粒編碼的抗生素抗性標記基因。)2，儲備甘油菌：制備10-15%甘油菌液，將高壓滅菌好的甘油放于4℃保存，然后將搖過的菌取出，將甘油與菌液一同放入無菌操作臺中，在滅菌條件下，用剪刀剪1ml槍頭一個小斜口，然后吸取400微升甘油放于3ml菌液中，然后進行渦旋震蕩，待甘油菌液混勻后，將甘油菌液封口，記下標記放于-20℃保存。注意事項：1，卡那霉素使用時，首先應(yīng)分裝到ep管中以100mg/ml,每管3ml
8、濃度放入5ml管中，-20℃保存。第二，質(zhì)粒DNA分子的大量提取1，準備材料：已
