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《定點突變和隨機突變PCR構(gòu)建噬菌體突變次級抗體庫方法的比較.pdf》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、1064細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志(ChinJCellMolImmuno1)2013，29(10·論著·文章編號：1007—8738(2013)10—1064—04定點突變和隨機突變PCR構(gòu)建噬菌體突變次級抗體庫方法的比較劉洋，余洋，王巖，趙煒疆(汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科學(xué)中心，廣東汕頭515041)[摘要]目的以突變TomlinsonI庫中篩選的抗細(xì)胞黏附分子L1的胞外區(qū)單鏈抗體為例，對定點突變和隨機突變兩種構(gòu)建噬菌體抗體次級庫的方法進(jìn)行比較。方法設(shè)計定點突變和隨機PCR引物在基因水平經(jīng)PCR、酶切、連接將已有噬菌粒引入突變后轉(zhuǎn)染大腸桿菌構(gòu)建噬菌體次級抗體庫；之后使用噬菌體ELISA確定
2、陽性單克隆比例，采用皮爾森X2檢驗進(jìn)行比較。結(jié)果兩種方法構(gòu)建的次級抗體庫庫容分別為1．4X10pfu／mL和2．5×10pfu／mL，兩庫陽性單克隆比例分別為32．5％和35．5％，二者相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0．05)。結(jié)論兩種突變方法都有望獲得高親和力的抗體。[關(guān)鍵詞]定點突變PCR；隨機突變PCR；噬菌體次級抗體庫；單克隆[中圖分類號]R392．11，Q754，Q782[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]AComparisonofsite-mutatedanderror-pronePCRmethodsforconstructingthesecondaryphageantibodylibrari
3、esLIUYang，YUYang，WANGYan，ZHAOWeijiangCenterforNeuroseienee，MedicalCollege，ShantouUniversity，Shantou515041，ChhaalAbstractlobjectiveTocomparesite-mutatedPCRanderror-pronePCRmethodsinconstructingthesecondaryphageantibodylibrariesderivedfr0maprimaryextracelulardomainofcelladhesionmoleculeL1(L1-ec
4、d)bindingsingle-chainvariablefragment(scFv)antibody．MethodsSecondarymutantphagelibrarieswereestablishedbytransfectingthemutatedphageattheDNAIeveltoEcoliTG1withdesignedsite-mutatedPCRorerror-pronePCRprimers．Usingtheselectedphagemidasthetemplate，themutatedplasmidwasamplifiedbyPCRandthenconstruc
5、tedwithrestrictionenzymecuttingandIigation．Phage-basedELISAwasusedtocalculatetheratiosofthepositivemonoclonesfromthetwoIibrariesandtheresultswerestatisticallycomparedusingthePearsonmethod．ResultsThesizeofthetwoIibrarieswere1．4×10。pfu／mL(site-mutatedlibrary)and2．5X10。pfu／mL(error-pronelibrary)
6、，respectively．Theratiosofpositivecloneswere32．5％and35．5％．respectively．ThePvaluewas0．67。showingnosignificantdiference．ConclusionThesetwomethodscanbewidelyusedtoobtainantibodieswithahighaffinityonthebasisoftheexistingphageantibody．[Keywords]site-mutatedPCR；error-pronePCR；secondaryphage-displaya
7、ntibodylibrary；monocJone隨著人們對抗體研究的不斷深入，基因工程抗熱點。噬菌體展示技術(shù)將抗體分子簡化為包含可變體以其可規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)點得到越來越廣泛的應(yīng)用。區(qū)的片段導(dǎo)人噬菌體基因組中，通過噬菌體表達(dá)單人源抗體庫篩選技術(shù)作為基因工程抗體的一種，能鏈抗體于噬菌體蛋白表面以用于快速篩選。同時該夠高效快速的在體外找到與特異性抗原結(jié)合的抗體。技術(shù)結(jié)合PCR等技術(shù)可方便有效的在體外實現(xiàn)突細(xì)胞黏附分子L1(celladhesionmoleculeL1，L1CAM)變，以增
