通過(guò)外源MYB基因的表達(dá)提高水稻的抗逆性.docx

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1、通過(guò)外源MYB基因的表達(dá)提高水稻的抗逆性MYB基因家族是植物中數(shù)量最多的一類轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,R2R3-MYB基因是MYB基因家族中最大的一個(gè)亞家族。R2R3-MYB基因不僅參與植物的發(fā)育及代謝過(guò)程,同時(shí)還在生物脅迫以及非生物脅迫耐性中發(fā)揮重要作用。AmROSEA1屬于R2R3-MYB蛋白,是調(diào)節(jié)金魚草花色素分布及密度的關(guān)鍵因子。AmRosea1之前被引入煙草、番茄、矮牽牛以及棉花等多個(gè)雙子葉物種中,并且顯著提高了轉(zhuǎn)基因植株花青素或其他次級(jí)代謝物的含量。為了研究AmRosea1異位表達(dá)對(duì)于水稻生長(zhǎng)發(fā)育的影響,我們將AmRosea1轉(zhuǎn)入日本晴水稻,檢

2、測(cè)了轉(zhuǎn)基因水稻中花青素以及類黃酮的含量,并進(jìn)行了高鹽脅迫以及干旱脅迫實(shí)驗(yàn)。我們發(fā)現(xiàn),外源AmRosea1基因能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)于高鹽脅迫以及干旱脅迫的耐性。我們對(duì)野生型水稻以及轉(zhuǎn)基因水稻在正常生長(zhǎng)環(huán)境以及高鹽或干旱脅迫條件下的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測(cè)序分析,發(fā)現(xiàn)一系列和脅迫相關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄水平受到了外源AmRosea1的影響。這些受影響的基因涉及脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、激素信號(hào)通路、離子平衡以及活性氧的清除。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1、獲得過(guò)量表達(dá)AmRosea1的轉(zhuǎn)基因水稻植株我們構(gòu)建了35S啟動(dòng)子啟動(dòng)AmRosea1過(guò)量表達(dá)的表達(dá)載體,并將其轉(zhuǎn)入水稻栽培品種日本晴

3、中。利用AmRosea1特定的引物,對(duì)抗性苗進(jìn)行PCR驗(yàn)證,共有24棵PCR陽(yáng)性植株。半定量實(shí)驗(yàn)證明OXR20,OXR21和OXR22三個(gè)植株中AmRosea1的表達(dá)量較高。2、測(cè)量花青素和總類黃酮的含量為檢測(cè)AmRosea1的過(guò)量表達(dá)對(duì)水稻花青素和總類黃酮積累量的影響,我們用分光光度法測(cè)量了成熟種子、三葉期以及抽穗期葉子中的含量,發(fā)現(xiàn)AmRosea1的過(guò)量表達(dá)并沒(méi)有影響轉(zhuǎn)基因水稻植株中花青素和總類黃酮的含量。3、檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)于高鹽和干旱脅迫的耐性經(jīng)干旱脅迫處理之后,OXR20、OXR21和OXR22的存活率分別為78%±5.6%,85%±

4、8.2%和80%±7.1%,均高于WT植株20.8%±1.7%的存活率;高鹽脅迫處理之后,OXR20、OXR21和OXR22的存活率分別為70%±5.9%、75%±5.6%和69%±4.3%,WT植株全部死亡。這些結(jié)果表明:過(guò)量表達(dá)AmROSEA1基因顯著提高了轉(zhuǎn)基因水稻植株對(duì)于干旱和高鹽脅迫的耐性。4、轉(zhuǎn)錄組分析為了研究轉(zhuǎn)基因株系脅迫耐性的分子機(jī)制,我們將OXR21作為轉(zhuǎn)基因株系的代表。取OXR21和WT在脅迫處理前以及脅迫處理不同時(shí)間點(diǎn)的葉片,進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。篩選與脅迫響應(yīng)相關(guān)的,在OXR21和WT之間差異表達(dá)的基因,結(jié)果如下:與WT相比,

5、在PEG處理的0h、6h和24h,OXR21中分別有64、282和50個(gè)干旱脅迫響應(yīng)基因表達(dá)上調(diào),49、240和33個(gè)干旱脅迫響應(yīng)基因表達(dá)下調(diào);在鹽處理的0h、1h和6h,OXR21中分別有49、197和58個(gè)鹽脅迫響應(yīng)基因表達(dá)上調(diào),34、266和26個(gè)鹽脅迫響應(yīng)基因表達(dá)下調(diào)。對(duì)差異表達(dá)基因的venn分析表明:分別有8個(gè)和12個(gè)基因在PEG處理的0h、6h、24h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)和鹽處理的0h、1h、6h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)都上調(diào);分別有20個(gè)基因在PEG處理的6h、24h和鹽處理的1h、6h的表達(dá)上調(diào);分別有15和26個(gè)基因在PEG處理的24h和鹽處理

6、的6h的表達(dá)上調(diào)。對(duì)差異表達(dá)基因的GO富集分析表明,在“生物學(xué)過(guò)程”這一類別里,干旱脅迫和鹽脅迫的差異基因分別富集到6個(gè)GOterm里,其中有4個(gè)是相同,它們是“對(duì)內(nèi)源性刺激響應(yīng)”“對(duì)非生物刺激響應(yīng)”“對(duì)脅迫響應(yīng)”和“對(duì)刺激響應(yīng)”。KEGG分析表明,無(wú)論是在干旱脅迫條件下還是在鹽脅迫條件下,與WT植株相比,轉(zhuǎn)基因植株中的茉莉酸信號(hào)通路均被促進(jìn),而乙烯信號(hào)通路均被抑制。差異表達(dá)的基因里包含有鉀離子高親和運(yùn)輸?shù)鞍?、果糖基轉(zhuǎn)移酶等與滲透保護(hù)相關(guān)的蛋白的編碼基因,以及過(guò)氧化氫酶(CAT)、過(guò)氧化物酶、抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)等與氧化脅迫相關(guān)的蛋白的

7、編碼基因。另外,RD22、熱激蛋白、LEA蛋白和RAB16A,這些脅迫響應(yīng)蛋白;轉(zhuǎn)錄因子DREB1F、MYB48和NAC134;信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,絲氨酸-蘇氨酸激酶、CIPK14、CIPK15的編碼基因的轉(zhuǎn)錄水平,在WT和轉(zhuǎn)基因植株之間也表現(xiàn)出差異。另外,還有一些不知功能的基因的表達(dá)被改變。總之,AmROSEA1在水稻中過(guò)量表達(dá)通過(guò)直接或間接地改變一系列基因的表達(dá)水平,使得轉(zhuǎn)基因水稻植株獲得了較WT高的鹽脅迫耐性和干旱脅迫耐性。被子植物的胚乳由受精極核發(fā)育而來(lái),為胚胎的發(fā)育提供一些信號(hào)。胚乳在種子發(fā)育的早期,為胚胎提供營(yíng)養(yǎng);在有永久胚乳的種子中,胚

8、乳還為萌發(fā)時(shí)的幼苗提供營(yíng)養(yǎng)。谷類種子的胚乳不僅是地球上人類和牲畜最重要的糧食資源,同時(shí)能為加工商品和生物燃料提供原材料。因此,研究胚乳的發(fā)育不僅具有重