肥大心肌細胞分析論文.doc

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1、肥大心肌細胞分析論文【摘要】目的：觀察壓力超負荷性肥大心肌細胞表面AT1和AT2受體mRNA表達的動態(tài)變化.方法：構(gòu)建壓力超負荷性心肌肥大模型，于不同時間點急性分離心肌細胞.采用RTPCR法觀察肥大心肌細胞中AT1和AT2mRNA表達的動態(tài)變化.結(jié)果：隨著大鼠心肌肥厚程度的逐漸加重，于術(shù)后4wk起，AT1與AT2mRNA的表達水平較之假手術(shù)組均逐漸升高，8wk時繼續(xù)升高.主動脈縮窄12wk組AT1的表達水平與8wk組無顯著性差異，但AT2的表達水平從0.438±0.088進一步升高至0.580±0.0

2、66，且差異有顯著性（P【關(guān)鍵詞】心肌細胞受體血管緊張素II1型受體血管緊張素II2型0引言目前已發(fā)現(xiàn)細胞表面主要存在著血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）的兩種受體，即Ⅰ型受體（AT1）及Ⅱ型受體（AT2）.已知AT1介導(dǎo)了幾乎所有AngⅡ的生物學(xué)效應(yīng)［1］，而AT2的功能至今尚不完全清楚.目前認(rèn)為，AT2與胚胎發(fā)育、細胞分化、凋亡等生物過程有關(guān)，且在某些方面具有與AT1相拮抗的作用.AT2可以減輕或逆轉(zhuǎn)心臟纖維化以及血管重塑［2］，從而對抗AT1介導(dǎo)的促纖維化作用；AT2可以引起血管舒張［3］，而這也與AT1引

3、起的血管收縮效應(yīng)相反.成年期AT2的表達水平低下，在某些病理條件下,AT2及AT1的表達水平將會發(fā)生變化.由于這兩型受體可能存在拮抗作用，因而在不同疾病條件下二者表達水平的變化將會對心臟的功能和結(jié)構(gòu)起重要的調(diào)節(jié)作用.目前，有關(guān)心肌肥大過程中心肌細胞上AngⅡ受體動態(tài)變化的報道不多.我們以壓力超負荷性肥大心肌細胞為實驗對象，觀察在細胞肥大過程中其表面AT1和AT2受體mRNA表達的動態(tài)變化及與心肌肥大之間的相互關(guān)系，以期進一步深入理解兩型受體在心肌肥大發(fā)生中的作用及其機制.1材料和方法1.1材料雄性SD大

4、鼠36只，體質(zhì)量220～250g（西安交通大學(xué)實驗動物中心).AngⅡ，collagenaseⅠ5學(xué)海無涯，protease及BSA（Sigma公司）.Trizol及Taq酶（Promega公司），dNTPs及100bpDNALadder（華美生物工程公司）.引物由上海康成生物技術(shù)有限公司合成.其它試劑均為進口或國產(chǎn)分析純.1.2方法1.2.1壓力超負荷性心肌肥大模型的構(gòu)建將實驗動物隨機分為2組各18只，腹主動脈縮窄組于左腎動脈上方小心分離長約3mm的腹主動脈，套以內(nèi)徑為0.8mm的銀夾造成縮窄；假手術(shù)

5、組除不以銀夾縮窄腹主動脈外，其余操作同腹主動脈縮窄組.術(shù)后分別飼養(yǎng)4wk（6只）、8wk（6只）及12wk（6只）.1.2.2心肌細胞的分離及心肌肥大指數(shù)測定采用膠原酶Langendorff法對心臟進行逆行灌流,待灌流結(jié)束首先測取左心室質(zhì)量(包括左心室游離壁和室間隔)，計算左心室質(zhì)量與體質(zhì)量比值(LV/BW).而后獲取含有左心室游離壁和室間隔的肥大心肌細胞.由于心肌細胞的體積和質(zhì)量較成纖維細胞、微血管內(nèi)皮細胞等大的多，因而經(jīng)50g溫和離心1min后，在置換上清液的同時梯度恢復(fù)溶液中Ca2+的濃度.此過程

6、重復(fù)3~4次后，基本去除所含非心肌細胞［4］.提取部分心肌細胞,使用目鏡測微尺測量心肌細胞橫徑（TDM）.高倍鏡下（10×40）隨機選取20個視野,計算其中桿狀心肌細胞橫徑，取其均值為該例左心室心肌細胞橫徑（LVTDM）.1.2.3RTPCR一步法提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR擴增.條件為：94℃變性1min,退火1min.72℃延伸1min，共30個循環(huán)，而后于72℃再延伸5min.引物序列、產(chǎn)物長度如下所示.βactin：正義鏈5′CCTGTACGCCAACACAGTGC3′，反義鏈

7、5′ATACTCCTGCTTGCTGATCC3′，211bp；AT1：正義鏈5′CAGCCGTCATCTACCGAAAC3′，反義鏈5′AGGAAAGGGAACACGAAGC3′,142bp；AT2：正義鏈5′ATCTGGCTGTGGCTGACTT3′,反義鏈5′AGCATATTTCTCAGGTGGG3′，362bp.以βactin作為內(nèi)參照，用二者凝膠成像后的灰度值與βactin相比，代表其相對表達水平.統(tǒng)計學(xué)處理：數(shù)據(jù)以x±s表示，GraphPadPrism統(tǒng)計軟件分析，不同時間點的LV/BW，

8、LVTDM，AT1和AT2mRNA的表達變化分析采用雙因素方差分析，各組間相互比較采用t檢驗，P2結(jié)果2.1左心室質(zhì)量/體質(zhì)量及心肌細胞橫徑大鼠腹主動脈縮窄術(shù)后4，8，12wk時LV/BW，LVTDM與其同時點假手術(shù)組相比均顯著增高(P5學(xué)海無涯2.2RTPCR與假手術(shù)組相比，隨著大鼠心肌肥厚程度的加重，AT1與AT2mRNA的表達水平于術(shù)后4wk起逐漸升高，8wk時繼續(xù)升高.12wk組AT1mRNA的表達水平(0.505±0.059)與