肥大心肌細胞分析論文.doc

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1、肥大心肌細胞分析論文【摘要】目的：觀察壓力超負荷性肥大心肌細胞表面AT1和AT2受體mRNA表達的動態(tài)變化.方法：構建壓力超負荷性心肌肥大模型，于不同時間點急性分離心肌細胞.采用RTPCR法觀察肥大心肌細胞中AT1和AT2mRNA表達的動態(tài)變化.結果：隨著大鼠心肌肥厚程度的逐漸加重，于術后4wk起，AT1與AT2mRNA的表達水平較之假手術組均逐漸升高，8wk時繼續(xù)升高.主動脈縮窄12wk組AT1的表達水平與8wk組無顯著性差異，但AT2的表達水平從0.438±0.088進一步升高至0.580±0.0

2、66，且差異有顯著性（P【關鍵詞】心肌細胞受體血管緊張素II1型受體血管緊張素II2型0引言目前已發(fā)現(xiàn)細胞表面主要存在著血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）的兩種受體，即Ⅰ型受體（AT1）及Ⅱ型受體（AT2）.已知AT1介導了幾乎所有AngⅡ的生物學效應［1］，而AT2的功能至今尚不完全清楚.目前認為，AT2與胚胎發(fā)育、細胞分化、凋亡等生物過程有關，且在某些方面具有與AT1相拮抗的作用.AT2可以減輕或逆轉心臟纖維化以及血管重塑［2］，從而對抗AT1介導的促纖維化作用；AT2可以引起血管舒張［3］，而這也與AT1引

3、起的血管收縮效應相反.成年期AT2的表達水平低下，在某些病理條件下,AT2及AT1的表達水平將會發(fā)生變化.由于這兩型受體可能存在拮抗作用，因而在不同疾病條件下二者表達水平的變化將會對心臟的功能和結構起重要的調節(jié)作用.目前，有關心肌肥大過程中心肌細胞上AngⅡ受體動態(tài)變化的報道不多.我們以壓力超負荷性肥大心肌細胞為實驗對象，觀察在細胞肥大過程中其表面AT1和AT2受體mRNA表達的動態(tài)變化及與心肌肥大之間的相互關系，以期進一步深入理解兩型受體在心肌肥大發(fā)生中的作用及其機制.1材料和方法1.1材料雄性SD大

4、鼠36只，體質量220～250g（西安交通大學實驗動物中心).AngⅡ，collagenaseⅠ5學海無涯，protease及BSA（Sigma公司）.Trizol及Taq酶（Promega公司），dNTPs及100bpDNALadder（華美生物工程公司）.引物由上海康成生物技術有限公司合成.其它試劑均為進口或國產分析純.1.2方法1.2.1壓力超負荷性心肌肥大模型的構建將實驗動物隨機分為2組各18只，腹主動脈縮窄組于左腎動脈上方小心分離長約3mm的腹主動脈，套以內徑為0.8mm的銀夾造成縮窄；假手術

5、組除不以銀夾縮窄腹主動脈外，其余操作同腹主動脈縮窄組.術后分別飼養(yǎng)4wk（6只）、8wk（6只）及12wk（6只）.1.2.2心肌細胞的分離及心肌肥大指數(shù)測定采用膠原酶Langendorff法對心臟進行逆行灌流,待灌流結束首先測取左心室質量(包括左心室游離壁和室間隔)，計算左心室質量與體質量比值(LV/BW).而后獲取含有左心室游離壁和室間隔的肥大心肌細胞.由于心肌細胞的體積和質量較成纖維細胞、微血管內皮細胞等大的多，因而經(jīng)50g溫和離心1min后，在置換上清液的同時梯度恢復溶液中Ca2+的濃度.此過程

6、重復3~4次后，基本去除所含非心肌細胞［4］.提取部分心肌細胞,使用目鏡測微尺測量心肌細胞橫徑（TDM）.高倍鏡下（10×40）隨機選取20個視野,計算其中桿狀心肌細胞橫徑，取其均值為該例左心室心肌細胞橫徑（LVTDM）.1.2.3RTPCR一步法提取細胞總RNA，逆轉錄成cDNA，PCR擴增.條件為：94℃變性1min,退火1min.72℃延伸1min，共30個循環(huán)，而后于72℃再延伸5min.引物序列、產物長度如下所示.βactin：正義鏈5′CCTGTACGCCAACACAGTGC3′，反義鏈

7、5′ATACTCCTGCTTGCTGATCC3′，211bp；AT1：正義鏈5′CAGCCGTCATCTACCGAAAC3′，反義鏈5′AGGAAAGGGAACACGAAGC3′,142bp；AT2：正義鏈5′ATCTGGCTGTGGCTGACTT3′,反義鏈5′AGCATATTTCTCAGGTGGG3′，362bp.以βactin作為內參照，用二者凝膠成像后的灰度值與βactin相比，代表其相對表達水平.統(tǒng)計學處理：數(shù)據(jù)以x±s表示，GraphPadPrism統(tǒng)計軟件分析，不同時間點的LV/BW，

8、LVTDM，AT1和AT2mRNA的表達變化分析采用雙因素方差分析，各組間相互比較采用t檢驗，P2結果2.1左心室質量/體質量及心肌細胞橫徑大鼠腹主動脈縮窄術后4，8，12wk時LV/BW，LVTDM與其同時點假手術組相比均顯著增高(P5學海無涯2.2RTPCR與假手術組相比，隨著大鼠心肌肥厚程度的加重，AT1與AT2mRNA的表達水平于術后4wk起逐漸升高，8wk時繼續(xù)升高.12wk組AT1mRNA的表達水平(0.505±0.059)與