土壤中分離純化細(xì)菌實(shí)驗(yàn).ppt

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1、微生物的分離與純化指導(dǎo)教師：王海麗實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、要求?）學(xué)習(xí)并掌握細(xì)菌、放線菌、霉菌和酵母菌等四大類微生物的稀釋分離、劃線分離等技術(shù)。（2）學(xué)習(xí)從樣品中分離、純化出所需菌株。（3）了解四大類微生物的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)時(shí)間。（4）學(xué)習(xí)平板菌落計(jì)數(shù)法（下次實(shí)驗(yàn)）。以細(xì)菌為例實(shí)驗(yàn)原理純種分離技術(shù)是微生物學(xué)中重要的基本技術(shù)之一。分離：從混雜的微生物群體中獲得單一菌株純培養(yǎng)的方法。純種（純培養(yǎng)）：一株菌種或一個(gè)培養(yǎng)物中所有的細(xì)胞或孢子都是由一個(gè)細(xì)胞分裂、繁殖而產(chǎn)生的后代。微生物的分離與純化技術(shù)的應(yīng)用：分離具有特殊功能的微生物、優(yōu)良菌種及純化被污染的菌種等。土壤

2、是微生物的大本營(yíng)，混雜著大量的微生物，從中分離可得到只含有這一種微生物的純培養(yǎng)。稀釋分離法有傾注法和涂布法兩種；菌種被其他雜菌污染時(shí)或混合菌懸液常用劃線法進(jìn)行純種分離。要獲得某種微生物的純培養(yǎng)，還需提供有利于該微生物生長(zhǎng)繁殖的最適培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件。微生物四大類菌的分離培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間詳見(jiàn)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)P67表格。細(xì)菌常用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，在30-37℃溫度下培養(yǎng)1-2天。平板菌落計(jì)數(shù)——活菌計(jì)數(shù)0.90.10.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.9ml分離純化基本流程實(shí)驗(yàn)儀器、材料實(shí)驗(yàn)材料菌源

3、:土樣10g;培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基;實(shí)驗(yàn)儀器與用具1)超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、酒精燈2）1000ul及100ul移液槍、1000ul及100ul槍頭、無(wú)菌1.5ml的離心管、離心管架3）無(wú)菌平皿、涂布棒、接種環(huán)實(shí)驗(yàn)試劑:無(wú)菌水;實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1、采土樣:選擇肥沃土壤,去表層土,挖10－20cm深度的土壤數(shù)10g,裝入已滅菌的牛皮紙袋,封好袋口,帶回實(shí)驗(yàn)室。2、制備土壤稀釋液：稱取土樣10g，放入盛90ml無(wú)菌水的三角瓶中，置搖床振蕩20min使土壤均勻分散成為土壤懸液（10-1）。用無(wú)菌吸管從中吸取1ml土壤懸液，注入事先分裝有90ml無(wú)菌水的試

4、管中，吹吸3次，振蕩均勻（10-3）。3、分離1）涂布法用一支新的無(wú)菌吸管，從10-2、10-3稀釋濃度土壤稀釋液中各吸取1ml，較均勻地放入已寫(xiě)好稀釋度的牛肉蛋白胨培養(yǎng)基平板上，用灼燒冷卻后的無(wú)菌玻璃涂棒涂勻。每個(gè)濃度做3個(gè)平板（重復(fù)）。2）傾注法用一支新的無(wú)菌吸管，由低濃度開(kāi)始，從各濃度土壤稀釋液中各吸取1ml，對(duì)號(hào)較均勻地放入已寫(xiě)好稀釋度的空白無(wú)菌平皿中，然后在各平皿中加入已經(jīng)融化并冷卻到45-50℃的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（已滅菌）12-15ml，將培養(yǎng)皿在超凈工作臺(tái)面上輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，使稀釋的菌懸液與融化的培養(yǎng)基混合均勻，直至培養(yǎng)基凝固。注意：

5、無(wú)菌操作.4、培養(yǎng)待平板上液體被完全吸收，將平板倒置于370C溫箱中培養(yǎng)24h；5、菌落計(jì)數(shù)含菌樣品的微生物經(jīng)稀釋分離培養(yǎng)后，每一個(gè)活菌細(xì)胞可在平板上繁殖形成一個(gè)肉眼可見(jiàn)的菌落，故可據(jù)平板上菌落的數(shù)目推算出每克含菌樣品中所含的活菌總數(shù)（菌落形成數(shù)目）。每克含菌樣品中微生物的活細(xì)胞數(shù)（菌落形成數(shù)，CFU＝（同一稀釋度平板上菌落平均數(shù)×10×稀釋倍數(shù)）/含菌樣品克數(shù)菌落計(jì)數(shù)規(guī)則：選擇平均菌落數(shù)在30~300間的平板1、只有一個(gè)稀釋度符合，以該稀釋度的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告；2、有兩個(gè)稀釋度符合，取決于二者比值（高稀釋度的菌落數(shù)除以低稀釋度的菌落

6、數(shù)的值）：1）若0.5≤比值≤2，以兩稀釋度的菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)所得的值的均值報(bào)告。2）若2≤比值或比值≤0.5，則取其中較少的菌落總數(shù)進(jìn)行報(bào)告。3、若所有稀釋度的菌落平均數(shù)均大于300，則按稀釋倍數(shù)最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告；4、若所有稀釋度的菌落平均數(shù)均小于30，則按稀釋倍數(shù)最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告；所有菌落數(shù)均不在30~300間以最接近30或300的平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)6、挑菌劃線分離挑取單個(gè)菌落（細(xì)菌菌落），分別在平板上做分區(qū)劃線。370C培養(yǎng)48h檢查菌落是否單純。劃線方法：無(wú)菌操作（近火焰處操作）：接種環(huán)灼燒滅菌、冷卻左

7、手取涂布分離培養(yǎng)后平板右手用接種環(huán)挑取涂布分離培養(yǎng)的平板中的目的單菌落用已經(jīng)粘有菌體的接種環(huán)于另一新的空白平板中劃線分區(qū)劃線法：灼燒、冷卻、取菌區(qū)1劃線灼燒、冷卻區(qū)2劃線灼燒、冷卻區(qū)3劃線完畢、灼燒結(jié)果與討論計(jì)算含菌樣品中的所含活菌總數(shù)在恒溫箱中培養(yǎng)微生物時(shí)為何要倒置？7、斜面接種選擇分離效果較好，認(rèn)為已經(jīng)純化的單菌落，挑選一個(gè)，用接種環(huán)接種斜面。貼好標(biāo)簽。8、培養(yǎng)置370C恒溫箱中培養(yǎng)24h，置冰箱保藏。