注射用重組人促紅素epo

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1、注射用重組人促紅素EPO（CHO細(xì)胞）3檢定3.1原液檢定3.1.1蛋白質(zhì)含量用4g/L碳酸氫銨溶液將供試品稀釋至0.5-2mg/ml，作為供試品溶液。以4g/L碳酸氫銨溶液作為空白測定供試品溶液在320nm，325nm，330nm，335nm,340nm，345nm和350nm的吸光度。用讀出的吸光度的對(duì)數(shù)與其對(duì)應(yīng)波長的對(duì)數(shù)做直線回歸，求得回歸方程。照紫外-可見分光光度法（附錄IIA），在波長276nm～280nm處，測定供試品溶液最大吸光度Amax，將Amax對(duì)應(yīng)波長帶入回歸方程求得供試品溶液由于光散射

2、產(chǎn)生的吸光度A光散射。按下式計(jì)算，應(yīng)不低于0.5mg/ml。蛋白質(zhì)含量（mg/ml）=（Amax-A光散射）÷7.43×供試品稀釋倍數(shù)×103.1.2生物學(xué)活性3.1.2.1體內(nèi)法依法測定（附錄ⅩB）。3.1.2.2體外法按酶聯(lián)免疫法試劑盒說明書測定。3.1.3體內(nèi)比活性每1mg蛋白質(zhì)應(yīng)不低于1.0×105IU。3.1.4純度3.1.4.1電泳法依法測定（附錄ⅣC）。用非還原SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法，考馬斯亮藍(lán)染色，分離膠膠濃度為12.5%，加樣量應(yīng)不低于10μg，經(jīng)掃描儀掃描，純度應(yīng)不低于98.0%。

3、3.1.4.2高效液相色譜法依法測定（附錄ⅢB）。親水硅膠體積排阻色譜柱，排阻極限300kD，孔徑24nm,粒度10μm，直徑7.5mm,長30cm；流動(dòng)相為3.2mmol/L磷酸氫二鈉-1.5mmol/L磷酸二氫鉀-400.4mmol/L氯化鈉，pH7.3；上樣量20～100μg，于波長280nm處檢測，以人促紅素色譜峰計(jì)算理論板數(shù)應(yīng)不低于1500。按面積歸一化法計(jì)算人促紅素純度，應(yīng)不低于98.0%。3.1.5分子量依法測定（附錄ⅣC）。用還原型SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法，考馬斯亮藍(lán)R250染色，分離膠

4、膠濃度為12.5%，加樣量應(yīng)不低于1μg，分子質(zhì)量應(yīng)為36～45kD。3.1.6紫外光譜掃描依法測定（附錄ⅡA），用水或生理氯化鈉溶液將供試品稀釋至0.5-2mg/ml,在光路1cm、波長230nm-360nm下進(jìn)行掃描，其最大吸收峰279nm±2nm；最小吸收峰250nm±2nm；在320～360nm處無吸收峰。3.1.7等電聚焦取尿素9g、30%丙烯酰胺單體溶液6.0ml、40%pH3-5的兩性電解質(zhì)溶液1.05ml、40%pH3-10的兩性電解質(zhì)溶液0.45ml、水13.5ml，充分混勻后，加入N，N

5、，N’，N’-四甲基乙二胺15μl和10%過硫酸銨溶液0.3ml，脫氣后制成凝膠，加供試品溶液20μl（濃度應(yīng)在每1ml含0.5mg以上），照等電聚焦電泳法進(jìn)行（附錄ⅣD），同時(shí)做對(duì)照。電泳圖譜應(yīng)與對(duì)照品一致。3.1.8唾液酸含量每1mol人促紅素應(yīng)不低于10.0mol(附錄ⅥC)。3.1.9外源性DNA殘留量每10000IU人促紅素應(yīng)不高于100pg（附錄ⅨB）。3.1.10CHO細(xì)胞蛋白殘留量用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法檢測，應(yīng)不高于蛋白質(zhì)總量的0.05%。3.1.11細(xì)菌內(nèi)毒素檢查每10000IU人促紅素應(yīng)

6、小于2EU（附錄ⅫE凝膠限量試驗(yàn)）。3.1.12牛血清白蛋白殘留量依法測定（附錄Ⅷ1），應(yīng)不高于0.01%。3.1.13肽圖（至少每年測定1次）供試品經(jīng)透析、凍干后,用1%碳酸氫銨溶液溶解并稀釋至1.5mg/ml，依法測定（附錄ⅧE），其中加入胰蛋白酶（序列分析純），37℃±0.5℃保溫6小時(shí)，色譜柱為反相C8柱(25cm×4.6mm，粒度5μm，孔徑30nm)，柱溫為45℃±0.5℃；流速為0.75ml/分鐘；進(jìn)樣量為20μl；按下表進(jìn)行梯度洗脫（表中A為0.1%三氟乙酸水溶液，B為0.1%三氟乙酸-80

7、%乙腈水溶液）。編號(hào)時(shí)間/分鐘流速/mlA%B%10.000.75100.00.0230.000.7585.015.0375.000.7565.035.04115.000.7515.085.05120.000.750.0100.06125.000.75100.00.07145.000.75100.00.0肽圖應(yīng)與人促紅素對(duì)照品一致。3.1.14N-末端氨基酸序列（至少每年測定1次）用氨基酸序列分析儀測定。N-末端序列應(yīng)為：Ala-Pro-Pro-Arg-Leu-Ile-Cys-Asp-Ser-Arg-Val

8、-Leu-Glu-Arg-Tyr。3.2半成品檢定3.2.1細(xì)菌內(nèi)毒素檢查依法測定,每1000IU人促紅素應(yīng)小于2EU（附錄ⅫE凝膠限量試驗(yàn)）。3.2.2無菌檢查依法檢查（附錄ⅫA），應(yīng)符合規(guī)定。3.3成品檢定除復(fù)溶時(shí)間、水分測定、和裝量差異檢查外，應(yīng)按標(biāo)示量加入滅菌注射用水，復(fù)溶后進(jìn)行其余各項(xiàng)檢定。3.3.1鑒別試驗(yàn)按免疫印跡法（附錄ⅧA）或免疫斑點(diǎn)法（附錄ⅧB）測定，應(yīng)為陽性。3.3.2物理檢查3.3.2.1