注射用重組人干擾素γ

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1、注射用重組人干擾素γZhusheyongChongzuRenGanraosuγRecombinantHumanInterferonγforInjection本品系由高效表達(dá)人干擾素γ基因的大腸桿菌，經(jīng)發(fā)酵、分離和高度純化后凍干制成。含適宜穩(wěn)定劑，不含防腐劑和抗生素。1基本要求生產(chǎn)和檢定用設(shè)施、原料及輔料、水、器具、動物等應(yīng)符合“凡例”的有關(guān)要求。2制造2.1工程菌菌種2．1.1名稱及來源重組人干擾素γ工程菌株系由帶有人干擾素γ基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株。2.1.2種子批的建立應(yīng)符合“生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理規(guī)程”的規(guī)定。2.1.3菌種檢定主種

2、子批和工作種子批的菌種應(yīng)進(jìn)行以下各項全面檢定。2.1.3.1劃種LB瓊脂平板應(yīng)呈典型大腸桿菌集落形態(tài)，無其他雜菌生長。2.1.3.2染色鏡檢應(yīng)為典型的革蘭陰性桿菌。2.1.3.3對抗生素的抗性應(yīng)與原始菌種相符。2.1.3.4電鏡檢查（工作種子批可免做）應(yīng)為典型大腸桿菌形態(tài)，無支原體、病毒樣顆粒及其他微生物污染。2.1.3.5生化反應(yīng)應(yīng)符合大腸桿菌生物學(xué)性狀。2.1.3.6干擾素表達(dá)量在搖床中培養(yǎng)，應(yīng)不低于原始菌種的表達(dá)量。2.1.3.7表達(dá)的干擾素型別應(yīng)用抗γ型干擾素參考血清做中和試驗，證明型別無誤。2.1.3.8質(zhì)粒檢查該質(zhì)粒的酶切圖譜應(yīng)與原始重組質(zhì)

3、粒相符。2.1.3.9目的基因核苷酸序列檢查（工作種子批可免做）目的基因核苷酸序列應(yīng)與批準(zhǔn)序列相符。2.2原液2.2.1種子液制備將檢定合格的工作種子批菌種接種于適宜的培養(yǎng)基（可含適量抗生素）中培養(yǎng)，供發(fā)酵罐接種用。2.2.2發(fā)酵用培養(yǎng)基采用適宜的不含任何抗生素的培養(yǎng)基。2.2.3種子液接種及發(fā)酵培養(yǎng)2.2.3.1在滅菌培養(yǎng)基中接種適量種子液。2.2.3.2在適宜的溫度下進(jìn)行發(fā)酵，應(yīng)根據(jù)經(jīng)批準(zhǔn)的發(fā)酵工藝進(jìn)行，并確定相應(yīng)的發(fā)酵條件，如溫度、pH值、溶氧、補(bǔ)料、發(fā)酵時間等。發(fā)酵液應(yīng)定期進(jìn)行質(zhì)粒丟失率檢查（附錄ⅨG）。2.2.4發(fā)酵液處理用適宜的方法收集處理

4、菌體。2.2.5初步純化采用經(jīng)批準(zhǔn)的純化工藝進(jìn)行初步純化，使其純度達(dá)到規(guī)定的要求。2.2.6高度純化經(jīng)初步純化后，采用經(jīng)批準(zhǔn)的工藝進(jìn)行高度純化，使其達(dá)到3.1項要求，即為干擾素γ原液。加入適宜穩(wěn)定劑,除菌過濾后保存于適宜溫度，并規(guī)定其有效期。2.2.7原液檢定按3.1項進(jìn)行。2.3半成品2.3.1配制與除菌2.3.1.1稀釋液配制按經(jīng)批準(zhǔn)的配方配制稀釋液。配制后應(yīng)立即用于稀釋。2.3.1.2稀釋與除菌將檢定合格加穩(wěn)定劑的干擾素原液用2.3.1.1項稀釋液稀釋至所需濃度。除菌過濾后即為半成品，保存于2～8℃。2.3.2半成品檢定按3.2項進(jìn)行。2.4成品

5、2.4.1分批應(yīng)符合“生物制品分批規(guī)程”規(guī)定。2.4.2分裝及凍干應(yīng)符合“生物制品分裝和凍干規(guī)程”規(guī)定。2.4.3規(guī)格應(yīng)為經(jīng)批準(zhǔn)的規(guī)格。2.4.4包裝應(yīng)符合“生物制品包裝規(guī)程”規(guī)定。3檢定3.1原液檢定3.1.1生物學(xué)活性依法測定（附錄ⅩC）。3.1.2蛋白質(zhì)含量依法測定（附錄ⅥB第二法）。3.1.3比活性為生物學(xué)活性與蛋白質(zhì)含量之比，每1mg蛋白質(zhì)應(yīng)不低于1.5×107IU。3.1.4純度3.1.4.1電泳法依法測定（附錄ⅣC）。用非還原型SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法，分離膠膠濃度為15%，加樣量應(yīng)不低于10μg(考馬斯亮藍(lán)R250染色法)或5μg(

6、銀染法)。經(jīng)掃描儀掃描，純度應(yīng)不低于95.0%（包括單體和二聚體）。3.1.4.2高效液相色譜法依法測定（附錄ⅢB）。色譜柱以適合分離分子質(zhì)量為5～60kD蛋白質(zhì)的色譜用凝膠為填充劑；流動相為0.1mol/L磷酸鹽-0.1mol/L氯化鈉緩沖液，pH7.0；上樣量不低于20μg，于波長280nm處檢測，以干擾素色譜峰計算理論板數(shù)應(yīng)不低于1000。按面積歸一化法計算，干擾素主峰(包括單體和二聚體)面積應(yīng)不低于總面積的95.0%。3.1.5分子量依法測定（附錄ⅣC）。用還原型SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法，分離膠膠濃度為15%，加樣量應(yīng)不低于1.0μg，制品

7、的分子質(zhì)量應(yīng)為16.8kD±1.768kD。3.1.6外源性DNA殘留量每1支次人用劑量應(yīng)不高于10ng（附錄ⅨB）。3.1.7宿主菌蛋白殘留量應(yīng)不高于總蛋白質(zhì)的0.10%（附錄ⅨC）。3.1.8殘余抗生素活性依法測定（附錄ⅨA），不應(yīng)有殘余氨芐西林或其他抗生素活性。3.1.9細(xì)菌內(nèi)毒素檢查每100萬IU應(yīng)小于10EU（附錄ⅫE凝膠限量試驗）。3.1.10等電點主區(qū)帶應(yīng)為8.1～9.1,供試品的等電點與對照品的等電點圖譜一致。（附錄ⅣD）。3.1.11紫外光譜掃描用水或生理氯化鈉溶液將供試品稀釋至約100μg/ml～500μg/ml，在光路1cm、波長

8、230nm～360nm下進(jìn)行掃描，最大吸收峰波長應(yīng)為280nm±3nm（附錄ⅡA）。3.1.1