實(shí)時(shí)定量pcr技術(shù)及其應(yīng)用

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1、實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)及其應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)及其應(yīng)用2004年5月28日姓名：肖云剛學(xué)號(hào)：12002244128（寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，2002級(jí)生物技術(shù)（1）班）摘要：實(shí)時(shí)定量PCR(Real-timeQuantitativePolymerasechainReaction,RQ-PCR)技術(shù)是20世紀(jì)90年代中期發(fā)展起來(lái)的一種新型核酸定量技術(shù)。該技術(shù)具有實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，快速，靈敏，精確等特點(diǎn)，是對(duì)原有PCR技術(shù)的革新，擴(kuò)大了PCR的應(yīng)用范圍.本文綜述了RQ-PCR技術(shù)的原理及其應(yīng)用。關(guān)鍵詞：實(shí)時(shí)定量，PCR,基因，熒光探針，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(polymerasechainreac

2、tion)(PCR)首見(jiàn)報(bào)道于1985年，是一種體外擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于人類(lèi)遺傳病的基因診斷，產(chǎn)前診斷，臨床醫(yī)學(xué)如傳染病致病原細(xì)菌即病毒的檢測(cè)，腫瘤，白血病的診斷，癌基因探索等，在分子生物學(xué)中應(yīng)用于基因組DNA或mRNA序列的直接測(cè)定，基因分離，克隆，定點(diǎn)致突變，基因突變的直接檢測(cè)以及法醫(yī)學(xué)等。之所以如此，是由于通過(guò)PCR可使極少量復(fù)雜的基因組DNA或總RNA樣品中特定基因片段，在短短幾小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增上百萬(wàn)倍拷貝。PCR技術(shù)自問(wèn)世以來(lái)得到了不斷發(fā)展，20世紀(jì)90年代發(fā)展起來(lái)的由美國(guó)Appliedbiosysems公司推出的實(shí)時(shí)定量PCR(Real-timeQuanti

3、tativePolymerasechainReaction,RQ-PCR)技術(shù)是一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基因利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)檢測(cè)整個(gè)PCR過(guò)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。它除了具有PCR的高靈敏性外，還具有可直接監(jiān)測(cè)擴(kuò)增中的熒光信號(hào)變化獲得定量結(jié)果，精確性高；定量和擴(kuò)增同步進(jìn)行，克服了PCR的平臺(tái)效應(yīng)；特異性和可靠性更強(qiáng)；能實(shí)現(xiàn)多重反應(yīng)；無(wú)污染性；具實(shí)時(shí)性和可靠性等特點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究領(lǐng)域和醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域。1：實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)的概述1.1兩個(gè)重要概念的說(shuō)明（1）熒光閾值（threshold）:以PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)，一

4、般熒光閾值定義為3~15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。（2）Ct值：也稱(chēng)循環(huán)閾值，C代表Cycle,t代表threshold。Ct值的含義是：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值是所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（如圖1所示）。經(jīng)數(shù)學(xué)證明，Ct值與模板DNA的起始拷貝數(shù)成反比。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代表Ct值（如圖2所示）。這樣，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。11.2作用原理RQ-PCR技術(shù)是指在PC反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量

5、分析的方法。它在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上添加了熒光染料或熒光探針。熒光染料能特異性摻入DNA雙鏈，發(fā)出熒光信號(hào)，而不摻入雙鏈中的染料分子不發(fā)出熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物增加完全同步。實(shí)時(shí)定量PCR常用的檢測(cè)模式有TaqMan探針和SYRBGreen1檢測(cè)模式。（1）TaqMan探針?lè)椒ǖ淖饔迷磉@種方法的原理主要是利用DNA的5’-3’核酸外切酶（常用Tap酶）活性并在PCR過(guò)程中,反應(yīng)體系加入一個(gè)熒光標(biāo)記探針.TapMan探針根據(jù)其3’端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)的不同分為兩種:常規(guī)TapMan探針和TapManMGB探針。常規(guī)TapMan探針利用合適的DNA的5’-3’核酸

6、外切酶（常用Tap酶）活性，特異性的切割探針5’端的熒光基團(tuán)。該探針的5’端和3’端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)FAM（6-羧基熒光素）和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)TAMRA（6-羧基四甲基若丹明）。當(dāng)溶液中有PCR產(chǎn)物時(shí)，該探針與模板退火，即產(chǎn)生了適合于核酸外切酶活性的底物，從而將探針5’端連接的熒光分子從探針上切割下來(lái)，破壞兩熒光分子間的PRET,發(fā)出熒光。2000年，美國(guó)AppliedBiosystems公司開(kāi)發(fā)了一種新的TapMan探針----MGB探針。這種熒光探針與常規(guī)TapMan探針相比，有兩個(gè)主要的不同：一是探針3’端標(biāo)記了自身不發(fā)光的淬滅熒光分子，以取代常規(guī)可發(fā)光的TAMRA

7、熒光標(biāo)記。這使熒光本底降低，熒光光譜分辨率得以大大改善。二是探針3’端另結(jié)合了MGB(minorgroovebinder)結(jié)合物，使得探針的Tm值提高，大大增加了探針的雜交穩(wěn)定性，使結(jié)果更精確，分辨率更高。實(shí)驗(yàn)證明，TapManMGB探針對(duì)等位基因的區(qū)分更為理想，甚至能檢測(cè)僅有單核苷酸差異的等位基因的表達(dá)水平。（2）SYBRGreen┃熒光染料方法的作用原理SYBRGreen┃是一種只與雙鏈DNA小溝結(jié)合的染料，當(dāng)它游離在溶液中時(shí)，不發(fā)出熒光；一旦摻入DNA雙鏈，便發(fā)出強(qiáng)烈的熒光