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1、RNA干擾某基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞Wnt信號通路影響第1章引言1.1乳腺癌的研究背景乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，隨著人們生活習(xí)慣、飲食結(jié)構(gòu)改變及激素替代治療應(yīng)用，乳腺癌發(fā)病率逐年上升。根據(jù)2012美國CancerStatistics顯示乳腺癌新發(fā)病例22.9萬，占所有腫瘤發(fā)病率第二位，超過肺癌，占女性腫瘤發(fā)病第一位［1］。中國近10年來乳腺癌發(fā)病率直線升高，根據(jù)2010年《中國乳腺疾病調(diào)查報告》［2］:我國城市中乳腺癌的死亡率增長了38.91%，乳腺癌發(fā)病率位居大城市女性腫瘤的第一位,乳腺癌已成為對婦女健康威脅最大的疾病。乳腺癌的主要治療手段包括手術(shù)、放化療及生
2、物靶向治療，復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院資料顯示乳腺癌5年總體生存率67%，即使是I、II期的早期乳腺癌術(shù)后仍然有20%左右復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，并因此導(dǎo)致死亡［3］。攻克乳腺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是提高乳腺癌療效的關(guān)鍵因素。1.2乳腺癌干細(xì)胞是乳腺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)干細(xì)胞是指一類具有自我更新能力和多向分化潛能的細(xì)胞群體。越來越多的證據(jù)顯示腫瘤是干細(xì)胞生長調(diào)控失調(diào)引起的異常組織增生。腫瘤中存在少部分腫瘤干細(xì)胞，腫瘤干細(xì)胞是指腫瘤中具有自我更新能力并能產(chǎn)生異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞。腫瘤干細(xì)胞在維持腫瘤的惡性增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等方面起著決定性作用，是腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移和治療后復(fù)發(fā)的根源之一[4]
3、。2003年Al-Hajj[5]等首次從乳腺癌患者腫瘤組織中分離出CD44+CD24-群細(xì)胞,這群細(xì)胞只需200個就可以在NOD/SCID鼠中經(jīng)5～6個月后形成大約1cm腫瘤。Sheridan等對13種乳腺癌細(xì)胞系研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌干細(xì)胞CD44+CD24-的比例與腫瘤細(xì)胞系的侵襲能力正相關(guān)，比例高的細(xì)胞系表達(dá)更高水平的促侵襲相關(guān)基因。后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌干細(xì)胞屬于慢分離細(xì)胞，可長時間處于細(xì)胞周期的G0期，對化療藥物具有抵抗性；高表達(dá)ABCG2/BRCP1，能將化療藥物排除細(xì)胞外；高表達(dá)ALDH1，加快細(xì)胞內(nèi)化療藥物的代謝；高表達(dá)survivin和BCL-2家族等
4、抗凋亡蛋白，抵抗化療、放療導(dǎo)致的凋亡[6]。早期乳腺癌患者的骨髓微轉(zhuǎn)移灶CD44+CD24-的乳腺癌干比例顯著高于原發(fā)腫瘤［7］，術(shù)前化療或內(nèi)分泌治療后殘存的乳腺癌組織中富含癌干細(xì)胞［8］。自我更新是指一個干細(xì)胞分裂為兩個子代細(xì)胞，但其中一個仍然保持與親代細(xì)胞完全相同的未分化狀態(tài)，而另一個則定向分化為成熟細(xì)胞。干細(xì)胞在這種不對稱分裂實現(xiàn)自我更新的同時，也通過分化、細(xì)胞周期的有序進(jìn)行為集體在生命過程中維持恒態(tài)。雖然乳腺腫瘤組織中的乳腺癌干細(xì)胞極少，但這些細(xì)胞具有無限自我更新的潛能，在啟動腫瘤形成和生長起著決定性的作用，是乳腺癌腫瘤組織形成、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)和源頭，
5、而其余的大多數(shù)細(xì)胞，經(jīng)過短暫的分化，最終都將死亡，因此只要找到乳腺癌干細(xì)胞，并對它實施靶向打擊，就可能從根本上摧毀乳腺癌細(xì)胞的母體，導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞陸續(xù)凋亡。第2章材料與方法2.1實驗材料人類乳腺癌Mcf-7細(xì)胞株作為實驗細(xì)胞株，購自上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫。2.1.2主要試劑及產(chǎn)地2.1.2.1RNAi慢病毒載體上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司完成RNAi慢病毒載體的構(gòu)建及包裝。從GeneBank得知SATB1有三個轉(zhuǎn)錄本，根據(jù)第一個轉(zhuǎn)錄本（NCBIRefSeq:NM-002971.4）的基因序列及RNA干擾序列設(shè)計原則，并通過設(shè)計軟件評估測定，選擇最佳的動力學(xué)參數(shù)設(shè)計
6、靶點；設(shè)計4個針對SATB1基因的干擾序列和RNAi陰性對照（MCF-7/siControl）Scramble序列（TTCTCCGAACGTGTCACGT）。構(gòu)建的目的慢病毒載體名稱：GV115，元件順序：hU6-MCS-CMV-EGFP。載體圖譜：2.2實驗方法和步驟①.從液氮中取出裝有MCF-7細(xì)胞的凍存管，立即投入37℃水浴中，輕微搖動。1-1.5分鐘后，待液體都融化細(xì)胞恢復(fù)懸浮狀態(tài)后，拿出凍存管噴少量酒精放入超凈工作臺。②.取15ml消毒離心管加入含10%血清10ml培養(yǎng)基，吸出上述凍存管中細(xì)胞懸液，加入15ml消毒離心管，用培養(yǎng)基把凍存管洗一遍，把粘在
7、壁上的細(xì)胞洗下來，1000轉(zhuǎn)離心5分鐘。③.棄上清，加含10%血清的6ml培養(yǎng)基重懸。接種于25ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，前后左右輕輕搖動，使培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞均勻分布。④.標(biāo)好細(xì)胞種類和日期、培養(yǎng)人名字等，放到37℃含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日更新培養(yǎng)基。⑤.每1-2天換一次培養(yǎng)基。第3章結(jié)果........203.1病毒轉(zhuǎn)染結(jié)果....203.2熒光定量PCR檢測各感染組MCF-7細(xì)胞的mRNA表達(dá)........233.3CF-7細(xì)胞SATB1蛋白表達(dá)........253.4流式細(xì)胞分選術(shù)分選乳腺癌MCF-7細(xì)胞得到乳腺癌干細(xì)胞.....263.5熒光定量PCR檢
8、測MCF-7、MCF-7
