pegfpbmi1真核表達(dá)載體的構(gòu)建、鑒定及其表達(dá)

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1、pEGFPBMI1真核表達(dá)載體的構(gòu)建、鑒定及其表達(dá)：陳鳳花，胡麗華，王琳，李一榮【摘要】本研究構(gòu)建真核表達(dá)載體pEGFPBMI1并觀察其在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)。將BMI1逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RTPCR)產(chǎn)物克隆入pEGFPN1，經(jīng)酶切、PCR鑒定及測序分析，構(gòu)建pEGFPBMI1真核表達(dá)載體；采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將融合基因pEGFPBMI1轉(zhuǎn)入HeLa細(xì)胞，用熒光顯微鏡和I1的全長編碼基因，序列測定的結(jié)果與預(yù)期設(shè)計完全一致。熒光顯微鏡下可見在轉(zhuǎn)染pEGFPBMI1的HeLa細(xì)胞中存在熒光分布；I1EGF

2、P的表達(dá)。在HeLa細(xì)胞中過表達(dá)BMI1顯著下調(diào)P16INK4amRNA的表達(dá)為對照組的9.2％(P<0.01)。結(jié)論：成功構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFPBMI1，轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后可表達(dá)融合蛋白BMI1EGFP。這為今后研究BMI1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)?！娟P(guān)鍵詞】基因轉(zhuǎn)染Construction,IdentificationandExpressionofRebinantEukaryoticVectorpEGFPBMI1AbstractThisstudyammalianexpressionvector

3、ofpEGFPBMI1andtodetectancervixcancercelllineHeLa.ThecDNAfragmentofBMI1obtainedbyRTPCRidedbyrestrictionenzymedigestion,PCRandDNAsequencing.pEGFPBMI1ine2000.TheexpressionofpEGFPBMI1inedbyEGFPfluorescenceandI1hasbeenshoedigestion,PCRandDNAsequencing.pEGFPBMI1co

4、uldexpressBMI1EGFPfusionproteininHeLacells.RealtimeRTPCRshoRNAexpressionatol2007;15(5):1056-1060PcG(polybgroup，PcG)基因家族以多蛋白復(fù)合體的形式調(diào)控靶基因的表達(dá)［1］，無論在果蠅還是哺乳動物的定向發(fā)育以及細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生命現(xiàn)象中都起著決定性的作用。在人類，PcG至少存在著兩種不同的復(fù)合體，一種為PRC1，包括BMI1、RING1、HPH1、HPH2、HPC1、HPC2、HPC3和CtBP；另一種為PR

5、C2，包括EED、EZH2、SUZ12、YY1和HDAC1/2。BMI1(Bcellspecificmoloneyleukemiavirusinsertionsite1，BMI1)是PcG家族PRC1復(fù)合體中的重要成員，為過表達(dá)cmyc轉(zhuǎn)基因小鼠中鑒定的原癌基因［2］，與果蠅PcG基因高度同源，在DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控、染色質(zhì)的穩(wěn)定、基因轉(zhuǎn)錄激活以及細(xì)胞凋亡等方面起著重要作用。選擇性敲除BMI1的小鼠可導(dǎo)致出生后進(jìn)行性發(fā)育遲緩、神經(jīng)系統(tǒng)的異常和嚴(yán)重的造血缺陷。本研究旨在構(gòu)建和鑒定真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFPBMI1并瞬

6、時轉(zhuǎn)染人宮頸癌細(xì)胞系HeLa，觀察其表達(dá)以及其對P16INK4amRNA表達(dá)的影響，為進(jìn)一步探討B(tài)MI1基因的生物學(xué)作用及其機(jī)制奠定基礎(chǔ)。材料和方法細(xì)胞培養(yǎng)真核表達(dá)載體的構(gòu)建、鑒定及其表達(dá)人類乳腺癌細(xì)胞系MCF7和宮頸癌細(xì)胞系HeLa按常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含10%新生牛血清的RPMI1640，在37℃、5%CO2的孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)。試劑和儀器載體pEGFPN1、細(xì)胞系MCF7和HeLa以及大腸桿菌E.coliDH5α由本室保存。RPMI1640培養(yǎng)液和新生牛血清購自Gibco公司。TRIZOL、Lipofectamine2000和O

7、ptiMEM為Invitrogen公司產(chǎn)品。逆轉(zhuǎn)錄試劑、T4DNA連接酶購自Promega公司。引物由上海博亞公司合成。各種限制性內(nèi)切酶和Pyrobest高保真酶、DNAMarkerDL2000和λEcoT14IdigestDNAMarker購自大連寶生物公司。膠回收試劑盒和質(zhì)粒小量抽提純化試劑盒購自上海華舜公司。βactin和BMI1抗體分別購自美國SantaCruz和Upstate公司。HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG、CF7細(xì)胞離心沉淀后溶于1mlTRIZOL后，接著按TRIZOL說明書進(jìn)行操作

8、。最后DEPC處理的蒸餾水溶解RNA，60℃孵育10分鐘，立即冰浴5分鐘，破壞RNA的二級結(jié)構(gòu)，電泳檢測RNA是否降解。cDNA合成反應(yīng)體系：①5×緩沖液：5μl；②dNTP(10mmolL)：2.0μl；③Oligo(dT)15pr