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1、開口箭皂苷體外抗腫瘤作用的初步實(shí)驗(yàn)研究作者：楊春艷，劉朝奇，鄒坤，汪鋆植，周永芹，劉小琴【摘要】 目的通過體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，探討開口箭皂苷的細(xì)胞毒活性及其機(jī)制，為進(jìn)行深層次研究提供依據(jù)。方法MTT比色法檢測細(xì)胞活力，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡。結(jié)果MTT結(jié)果顯示，開口箭總皂苷、30%皂苷和70%皂苷對Hela和HepG2細(xì)胞的抑制作用顯著，與陰性對照組相比有非常顯著性差異（P<0.005）。開口箭總皂苷、30%皂苷和70%皂苷和環(huán)磷酰胺對Hela細(xì)胞IC50分別為1372.92，3138.51，729.72，3459.08μg/ml；
2、對HepG2細(xì)胞IC50分別為1221.39，2657.53，562.70，3668.51μg/ml。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，開口箭總皂苷、30%總皂苷在濃度為2500μg/ml時，70%總皂苷和環(huán)磷酰胺在濃度為1250μg/ml時主要將Hela細(xì)胞細(xì)胞周期阻滯于S期，且能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。結(jié)論開口箭皂苷對Hela和HepG2細(xì)胞較環(huán)磷酰胺具有明顯的抑制作用，其中對HepG2細(xì)胞株較為敏感，且能將Hela細(xì)胞細(xì)胞周期阻滯于S期從而誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡?！娟P(guān)鍵詞】開口箭；皂苷；MTT法；流式細(xì)胞儀 開口箭TupistrachinensisBak.
3、系百合科Liliaceae鈴蘭族開口箭屬植物，為著名的傳統(tǒng)中藥。醫(yī)學(xué)古籍記載，開口箭味甘微苦，性寒，主治勞熱咳嗽、跌打損傷、風(fēng)濕痹痛、月經(jīng)不調(diào)、崩漏帶下等癥；其中中醫(yī)認(rèn)為月經(jīng)不調(diào)、崩漏帶下即是現(xiàn)代宮頸癌的常見癥狀。初步實(shí)驗(yàn)表明開口箭具有祛痰、抗炎、抑菌及醒酒作用［1，2］?！ ”緦?shí)驗(yàn)室通過實(shí)驗(yàn)顯示湖北省產(chǎn)開口箭含有甾體皂苷和甾體皂苷元,且含量較高［3］。有關(guān)研究結(jié)果表明，皂苷具有增強(qiáng)免疫功能、抗輻射、抑制腫瘤生長、抗炎、降血糖等廣泛的生物學(xué)活性,近年越來越受人們的普遍關(guān)注。有研究證實(shí)開口箭同屬植物皂苷成分有細(xì)胞毒活性［4，5］。本文旨在通過體外抗腫
4、瘤實(shí)驗(yàn),觀察開口箭皂苷對宮頸癌細(xì)胞Hela細(xì)胞和肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞的細(xì)胞毒活性,并通過流式細(xì)胞儀評價開口箭活性部位對Hela細(xì)胞細(xì)胞周期的影響和誘導(dǎo)該腫瘤細(xì)胞凋亡情況?，F(xiàn)報道如下?！ ?材料與儀器 1.1細(xì)胞株人宮頸癌細(xì)胞（Hela）、人肝癌細(xì)胞(HepG2)均由三峽大學(xué)分子生物學(xué)研究所提供。 1.2藥品與儀器RPMI-1640為美國GIBCO公司產(chǎn)品；新生小牛血清為杭州四季青生物材料有限公司產(chǎn)品；HEPES為美國Sigma公司產(chǎn)品；胰蛋白酶為美國GIBCO公司產(chǎn)品；四氮唑藍(lán)(MTT)為美國AMRESCO公司產(chǎn)品；環(huán)磷酰胺(CP,江蘇恒瑞醫(yī)
5、藥股份有限公司，批號：07020121)。酶聯(lián)免疫檢測儀(GENIOSTECAN)；CO2培養(yǎng)箱（日本三洋公司）；LD4-2A離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)；96孔板(美國Cornning公司)。 開口箭根莖于2002-07采自湖北省神農(nóng)架林區(qū)，經(jīng)三峽大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院陳發(fā)菊副教授鑒定為TupistrachinensisBak.，標(biāo)本存放于湖北省天然產(chǎn)物研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（No.TC200207SNJ）?！ ?方法 2.1藥物制備開口箭根莖粉碎后，用甲醇回流提取，合并提取液，濃縮后經(jīng)氯仿脫脂后用水飽和的正丁醇萃取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收正丁醇，濃縮液抽
6、干后即得到開口箭總皂苷，配成水液，過大孔樹脂柱，水洗，30%乙醇、70%乙醇、95%乙醇梯度洗脫，得開口箭4部分皂苷?！ 》謩e取開口箭總皂苷、30%開口箭皂苷、70%開口箭皂苷兩個樣品，用PBS配制成所需濃度，依次為312.5，625，1250，2500，5000，10000μg/ml，70%開口箭皂苷用PBS配制成所需濃度，依次為156.25，312.5，625，1250，2500，5000μg/ml，所有受試樣品均用0.22μm微孔濾膜過濾除菌。環(huán)磷酰胺(CP)用DMSO將其配置為500mg/ml。 2.2細(xì)胞培養(yǎng)Hela和HepG2細(xì)胞用R
7、PMI-1640培養(yǎng)液（另加10mmol/LHEPES、2.0mg/mlNaHCO3、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素和10%新生小牛血清），于CO2孵箱中37℃，5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)。貼壁細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化傳代?！ ?.3開口箭活性部位對Hela和HepG2細(xì)胞殺傷作用最佳實(shí)驗(yàn)條件的選擇MTT法實(shí)驗(yàn)條件的初步優(yōu)化，主要是對溶解藥物的溶劑（水、PBS）、加藥前的培養(yǎng)時間（6，12，24h）、藥物劑量和細(xì)胞密度進(jìn)行了摸索。其中密度細(xì)胞分別取0.1×105，0.5×105，0.8×105，1×105個/ml,接種于96孔培養(yǎng)板
8、,每孔接種100μl，轉(zhuǎn)板24h后加不同濃度的開口箭活性部位，繼續(xù)培養(yǎng)48h，以MTT法測定吸光度，比較不同細(xì)胞密度的線性
