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1、MM_FS_CNJ_0337出口食品副溶血性弧菌檢驗(yàn)MM_FS_CNJ_0337出口食品副溶血性弧菌檢驗(yàn)方法1.適用范圍本方法適用于海產(chǎn)食品中副溶血性弧菌檢驗(yàn)，其他食品可參照使用。2.主要試劑和儀器2.1.主要試劑（包括培養(yǎng)基）30g／L氯化鈉稀釋液：見(jiàn)6.1；60g／L氯化鈉蛋白胨水（PW）：見(jiàn)6.2；氯化鈉多粘菌素B肉湯（SPB）：見(jiàn)6.3；硫代硫酸鈉、檸檬酸鈉、膽鹽、蔗糖瓊脂（TCBS）：見(jiàn)6.4；氯化鈉三糖鐵瓊脂（TSI）：見(jiàn)6.5；嗜鹽性試驗(yàn)用胰胨水（TB）：見(jiàn)6.6；胰胨大豆瓊脂斜面（TSA）：見(jiàn)6.7；靛基質(zhì)試驗(yàn)用培養(yǎng)基（I）：見(jiàn)6.8；氨基酸試驗(yàn)用培養(yǎng)基
2、：見(jiàn)6.9；V－P半固體瓊脂（VP）：見(jiàn)6.10；糖類(lèi)分解試驗(yàn)用培養(yǎng)基：見(jiàn)6.11；42℃生長(zhǎng)試驗(yàn)用培養(yǎng)基：見(jiàn)6.12；O／F試驗(yàn)用培養(yǎng)基（HLGB）：見(jiàn)6.13；神奈川現(xiàn)象試驗(yàn)用我妻氏瓊脂（WA）：見(jiàn)6.14。2.2.儀器試管：17mm×170mm、15mm×150mm、10mm×100mm；吸管：1mL、10mL；培養(yǎng)皿：直徑90mm；廣口瓶或三角瓶；電動(dòng)均質(zhì)器；電動(dòng)試管振蕩器；37℃恒溫箱；42℃恒溫水浴箱；試管架。3.過(guò)程簡(jiǎn)述3.1.樣品制備3.1.1.冷凍樣品應(yīng)在45℃以下不超過(guò)15min或在2～5℃不超過(guò)18h解凍。若不能及時(shí)檢驗(yàn)，應(yīng)放于－15℃左右保存；非
3、冷凍而易腐的樣品應(yīng)盡可能及時(shí)檢驗(yàn)，若不能及時(shí)檢驗(yàn)，應(yīng)置于6～10℃冰箱保存，在24h內(nèi)檢驗(yàn)。3.1.2.取樣：以無(wú)菌操作進(jìn)行。3.1.2.1.魚(yú)類(lèi)：取魚(yú)體不同部位。3.1.2.2.貝類(lèi)：取內(nèi)臟或含內(nèi)臟的全部貝肉；如為帶殼貝類(lèi)，則應(yīng)先在清潔的流水中洗刷凈外殼，然后以無(wú)菌操作打開(kāi)貝殼，取出內(nèi)臟或含內(nèi)臟的全部貝肉和貝液。3.1.2.3.甲殼類(lèi)：取包括鰓及腸的部分或整體。3.1.3.以無(wú)菌操作稱(chēng)取50g檢樣放于均質(zhì)杯中，以滅菌剪刀充分剪碎。3.1.4.加30g／L氯化鈉稀釋水450mL，均質(zhì)（8000r／min）1min，使成1∶10稀釋液（如無(wú)均質(zhì)器，則應(yīng)以剪刀盡量剪碎，加4
4、50mL稀釋水使成1∶10稀釋液，并充分振蕩）。3.1.5.用1mL滅菌吸管吸取1∶10稀釋液1mL，注入裝有9mL30g／L氯化鈉稀釋水的試管內(nèi)，振搖試管混合均勻，制成1∶100稀釋液。3.1.6.每一稀釋度換取1支1mL滅菌吸管，按上項(xiàng)操作順序進(jìn)行10倍遞增稀釋。稀釋倍數(shù)要依據(jù)有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)、規(guī)定、要求或樣品污染情況而定。3.2.增菌培養(yǎng)和分離3.2.1.對(duì)新鮮樣品，可選擇3個(gè)連續(xù)適宜的稀釋度，分別以1mL無(wú)菌吸管各吸取1mL稀釋液，接種10mL單料氯化鈉多粘菌素B肉湯中，進(jìn)行選擇性增菌培養(yǎng)，每一稀釋度接種3管（若選擇的稀釋度為接種1g樣品時(shí)，則應(yīng)以10mL滅菌吸管吸取1
5、∶10稀釋液10mL，接種10mL雙料氯化鈉多粘菌素B肉湯中）。對(duì)經(jīng)加熱、輻射處理或冷藏、凍結(jié)的樣品，可按以上操作先將樣品接種于60g／L氯化鈉蛋白胨水于37℃前增菌18～24h，然后將培養(yǎng)物以接種環(huán)轉(zhuǎn)種到氯化鈉多粘菌素B肉湯中進(jìn)行選擇性增菌。3.2.2.37℃培養(yǎng)18～24h。3.2.3.氯化鈉多粘菌素B肉湯管如有菌生長(zhǎng)，則以3mm直徑接種環(huán)分別取一環(huán)菌液，劃線于硫代硫酸鈉、檸檬酸鈉、膽鹽、蔗糖瓊脂（TCBS）平板上。3.2.4.37℃培養(yǎng)18～24h。3.2.5.副溶血性弧菌在蔗糖瓊脂（TCBS）平板上的典型菌落呈圓形，邊緣整齊、濕潤(rùn)、稍混濁、半透明，多數(shù)具尖心、斗
6、笠狀，藍(lán)綠色菌落，直么2～4mm。3.3.生化鑒定3.3.1.在蔗糖瓊脂（TCBS）平板上如出現(xiàn)典型或可疑菌落，每個(gè)平板至少挑取兩個(gè)菌落，每個(gè)菌落分別順次接種到下列培養(yǎng)基進(jìn)行鑒別試驗(yàn)。3.3.1.1.無(wú)鹽胰胨水。3.3.1.2.30g／L氯化鈉胰胨水。3.3.1.3.氯化鈉三糖鐵瓊脂：先穿刺后劃線。3.3.2.37℃培養(yǎng)18～24h。3.3.3.選取在氯化鈉三糖鐵斜面上產(chǎn)堿，在底層產(chǎn)酸，不產(chǎn)氣，不產(chǎn)硫化氫；在無(wú)鹽胰胨水中幾乎不生長(zhǎng)；在30g／L氯化鈉胰胨水中生長(zhǎng)旺盛的菌株進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢，副溶血性弧菌為革蘭氏陰性，呈棒狀、弧狀、卵圓狀等多形態(tài)，兩端濃染、無(wú)芽胞。如符
7、合，繼續(xù)進(jìn)行以下生化鑒定。3.3.3.1.嗜鹽性試驗(yàn)：各取一環(huán)30g／L氯化鈉胰胨水培養(yǎng)物，分別接種到70g／L及100g／L氯化鈉胰胨水中，37℃培養(yǎng)18～24h。3.3.3.2.細(xì)胞色素氧化酶試驗(yàn)：取一環(huán)30g／L氯化鈉胰胨水培養(yǎng)物劃線到胰胨大豆瓊脂斜面上，37℃培養(yǎng)18～24h。3.3.3.3.靛基質(zhì)試驗(yàn)：在3.3.1.2的30g／L氯化鈉胰胨水培養(yǎng)物中加靛基質(zhì)試劑后觀察反應(yīng)。3.3.3.4.賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)：由氯化鈉三糖鐵斜面以接種針取少許培養(yǎng)物接種到賴氨酸試驗(yàn)用培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18～24h。3.3.3.5.精氨酸雙水解酶試驗(yàn)
