副溶血性弧菌檢驗(yàn)

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1、副溶血性弧菌檢驗(yàn)副溶血性弧菌（Vibrioparahaemolyticus）是廣泛分布于海水、海底泥沙、浮游生物和魚貝類中的海洋性細(xì)菌，為海產(chǎn)食品引起急性胃腸炎的重要病原菌之一，尤其是在夏秋季節(jié)的沿海地區(qū)，經(jīng)常由于食用帶有大量副溶血性弧菌的海產(chǎn)食品，引起爆發(fā)性食物中毒。在非沿海地區(qū)，因食用此菌污染的食品而引起中毒者亦時(shí)有發(fā)生。為保障食品衛(wèi)生質(zhì)量和食用安全，根據(jù)副溶血性弧菌的特性，進(jìn)行下列檢驗(yàn)，以便鑒別診斷。第一節(jié)副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)的檢驗(yàn)方法一、檢驗(yàn)方法（一）操作步驟1.分離培養(yǎng)：首先稱取樣品25g，加225mL

2、3.5％滅菌鹽水，用均質(zhì)器打碎或用乳缽磨碎，接種氯化鈉瓊脂平板和嗜鹽性瓊脂平板各一個(gè)，同時(shí)取10mL加入100mL增菌液中，放37℃8~16h培養(yǎng)后，涂上述平板進(jìn)行分離，37℃培養(yǎng)18~24h取出觀察，挑取可疑菌落，轉(zhuǎn)種3.5％氯化鈉三糖鐵斜面，37℃、24h觀察結(jié)果。2.涂片鏡檢：將三糖鐵培養(yǎng)基上反應(yīng)可疑者即底層變黃（葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣）、上層斜面不變（乳糖、蔗糖不分解）、有動(dòng)力、不產(chǎn)生硫化氫，進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢形態(tài)。3.嗜鹽性試驗(yàn)：將上述可疑培養(yǎng)物分別接種不同含量的鹽胨水（0％，3％，7％，10％）于37℃

3、24h培養(yǎng)后觀察生長(zhǎng)情況，在無鹽和10％鹽的胨水中不生長(zhǎng)，在3％和7％鹽的胨水中生長(zhǎng)良好者，繼續(xù)進(jìn)行下列有關(guān)試驗(yàn)。4.生化試驗(yàn)：分別接種下列各類生化培養(yǎng)基，葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、甲基紅、靛基質(zhì)、V-P，賴氨酸、鳥氨酸、精氨酸、硫化氫及溶血性試驗(yàn)，放37℃培養(yǎng)，除V-P、靛基質(zhì)和甲基紅試驗(yàn)培養(yǎng)48h后加試劑觀察外，其他均在24h觀察結(jié)果。5.動(dòng)物試驗(yàn)：將上述符合各類反應(yīng)的副溶血性弧菌，接種3.5％氯化鈉胨水，經(jīng)37℃、16~18h培養(yǎng)后，小鼠腹腔注射0.3mL，觀察2~3d，將死亡小鼠進(jìn)行解剖作分離培養(yǎng)。

4、（二）檢驗(yàn)程序圖6-1　副溶血性弧菌檢驗(yàn)程序二、結(jié)果分析判定及注意事項(xiàng)（一）樣品處理采樣時(shí)應(yīng)注意首選準(zhǔn)備好滅菌用具及容器，以無菌手續(xù)取有代表性的樣品，樣品必須盡快送檢，不宜存放時(shí)間過長(zhǎng)，副溶血性弧菌在適宜溫度下繁殖較快，但不適于低溫生存，在寒冷的情況下容易死亡，防止待檢材料冷凍，以免影響檢驗(yàn)結(jié)果。對(duì)采取的樣品有時(shí)因受存放條件的影響（如低溫冷凍或干燥時(shí)間過長(zhǎng)等原因），使菌體處于受傷狀態(tài)，故需對(duì)此類可疑食品或可疑中毒材料進(jìn)行增菌培養(yǎng)，但應(yīng)注意為有利于細(xì)菌恢復(fù)，不宜選用抑制性較強(qiáng)的培養(yǎng)基，否則影響細(xì)菌生長(zhǎng)。樣品經(jīng)增

5、菌8~16h后，轉(zhuǎn)種平板進(jìn)行分離，挑選可疑菌落，接種于含有3.5％鹽的三糖鐵培養(yǎng)基，此時(shí)挑選數(shù)目不應(yīng)少于5個(gè)，尤其夏季海產(chǎn)食品混放，相互污染嚴(yán)重，時(shí)有不同型別的大量細(xì)菌存在，以防漏檢。（二）形態(tài)與染色為革蘭氏陰性無芽胞桿菌，易呈多形態(tài)，有棒狀、弧狀、卵圓狀、球狀、絲狀等，排列不規(guī)則，多數(shù)散在，偶而有成對(duì)排列，一般大小為0.3~0.7ｕm×1~2ｕm，單端一根鞭毛，有動(dòng)力，運(yùn)動(dòng)活潑，兩端濃染，在固體培養(yǎng)條件下能生長(zhǎng)周鞭毛。（三）培養(yǎng)特性在普通瓊脂培養(yǎng)基和普通液體培養(yǎng)基中都可生長(zhǎng)，在無鹽的條件下不生長(zhǎng)，在含2％~

6、3％氯化鈉的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最旺盛，氯化鈉溶液濃度到達(dá)10％以上時(shí)不繁殖。在肉湯和胨水等液體培養(yǎng)基中混濁生長(zhǎng)，需氧性強(qiáng)，常在液體表面形成菌膜，在液體培養(yǎng)條件下菌體多生長(zhǎng)為單鞭毛，運(yùn)行活潑。在固體培養(yǎng)基上，菌落常為隆起，圓形，稍混濁不透明，表面光滑，濕潤(rùn)，不產(chǎn)生色素。在比較新鮮濕潤(rùn)或軟瓊脂培養(yǎng)基上，有些副溶血性弧菌可形成不規(guī)則菌落或片狀擴(kuò)散生長(zhǎng)，在0.7％以上瓊脂的培養(yǎng)基上能生長(zhǎng)周鞭毛（側(cè)毛）。一般在20~25℃培養(yǎng)生長(zhǎng)的周鞭毛較為穩(wěn)定，而在37℃培養(yǎng)或24h以上的培養(yǎng)物，周鞭毛易于由菌體自發(fā)脫落，具有周鞭毛的菌株

7、，在固體培養(yǎng)基上多表現(xiàn)擴(kuò)散生長(zhǎng)，單鞭毛的菌株在固體培養(yǎng)基上呈典型菌落，不表現(xiàn)擴(kuò)散生長(zhǎng)。培養(yǎng)基的成分、種類、溫度、濕度等條件的不同，都能對(duì)擴(kuò)散生長(zhǎng)有所影響，菌落形態(tài)也容易受條件的影響有所改變，如在嗜鹽性平板上一般生長(zhǎng)良好，而在SS瓊脂平板上多呈較小的扁平菌落，不易挑起。在血平反上生長(zhǎng)快可出現(xiàn)溶血環(huán)，在BCBS（硫代硫酸鹽，檸檬酸鹽，膽鹽，蔗糖）和氯化鈉蔗糖瓊脂平板上，呈淡藍(lán)或藍(lán)綠色菌落。一般由腹瀉病人初期分離者多為典型菌落，長(zhǎng)期保存的細(xì)菌或條件不適宜時(shí)，常有菌落變粗糙，形狀不整齊或菌落出現(xiàn)解離，有的在液體培養(yǎng)時(shí)

8、呈沉淀生長(zhǎng)現(xiàn)象。pH生長(zhǎng)范圍為5~10，最適pH為7.2~8.2，發(fā)育最適溫度為30~37℃。（四）生化特性本菌對(duì)葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不分解乳糖和蔗糖，能分解甘露醇，產(chǎn)生靛基質(zhì)，不產(chǎn)生硫化氫，甲基紅陽性，V-P陰性，賴氨酸陽性，精氨酸陰性，鳥氨酸多數(shù)為陽性少數(shù)呈陰性，溶血性多數(shù)陽性，有少數(shù)不溶血，主要生物化學(xué)性狀見表6-1。近年來由于細(xì)菌學(xué)基礎(chǔ)研究的深入和檢驗(yàn)技術(shù)的進(jìn)步，逐漸對(duì)一些海水來源的嗜鹽性弧菌