土壤酶活性測定方法

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1、土壤酶活性測定方法土壤脲酶的測定方法（苯酚鈉—次氯酸鈉比色法）一、原理脲酶存在于大多數(shù)細(xì)菌、真菌和高等植物里。它是一種酰胺酶作用是極為專性的，它僅能水解尿素，水解的最終產(chǎn)物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活性，與土壤的微生物數(shù)量、有機(jī)物質(zhì)含量、全氮和速效磷含量呈正相關(guān)。根際土壤脲酶活性較高，中性土壤脲酶活性大于堿性土壤。人們常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素狀況。土壤中脲酶活性的測定是以脲素為基質(zhì)經(jīng)酶促反應(yīng)后測定生成的氨量，也可以通過測定未水解的尿素量來求得。本方法以尿素為基質(zhì)，根據(jù)酶促產(chǎn)物氨與苯酚—次氯酸鈉作用生成藍(lán)色的靛酚，來分析脲酶活性。二、試劑1）甲苯2）10%尿素：稱取10g尿素，

2、用水溶至100ml。3）檸檬酸鹽緩沖液（PH6.7）：184g檸檬酸和147.5g氫氧化鉀（KOH）溶于蒸餾水。將兩溶液合并，用1mol/LNaOH將PH調(diào)至6.7，用水稀釋定容至1000ml。4）苯酚鈉溶液（1.35mol/L）：62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀釋至100ml（A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。將A、B溶液保存在冰箱中。使用前將A液、B液各20ml混合，用蒸餾水稀釋至100ml。5）次氯酸鈉溶液：用水稀釋試劑，至活性氯的濃度為0.9%，溶液穩(wěn)定。6）氮的標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確稱取0.4717g硫酸銨溶于水并稀釋至

3、1000ml，得到1ml含有0.1mg氮的標(biāo)準(zhǔn)液；再將此液稀釋10倍（吸取10ml標(biāo)準(zhǔn)液定容至100ml）制成氮的工作液（0.01mg/ml）。三、操作步驟稱取5g土樣于50ml三角瓶中，加1ml甲苯，振蕩均勻，15min后加10ml10%尿素溶液和20mlPH6.7檸檬酸鹽緩沖溶液，搖勻后在37℃恒溫箱培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)結(jié)束后過濾，過濾后取1ml濾液加入50ml容量瓶中，再加4ml苯酚鈉溶液和3ml次氯酸鈉溶液，隨加隨搖勻。20min后顯色，定容。1h內(nèi)在分光光度計與578nm波長處比色。（靛酚的藍(lán)色在1h內(nèi)保持穩(wěn)定）。標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：在測定樣品吸光值之前，分別取0、1、3、5、7、

4、9、11、13ml氮工作液，移于50ml容量瓶中，然后補(bǔ)加蒸餾水至20ml。再加入4ml苯酚鈉溶液和3ml次氯酸鈉溶液，隨加隨搖勻。20min后顯色，定容。1h內(nèi)在分光光度計上于578nm波長處比色。然后以氮工作液濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。注意事項:1、每一個樣品應(yīng)該做一個無基質(zhì)對照，以等體積的蒸餾水代替基質(zhì)，其他操作與樣品實驗相同，以排除土樣中原有的氨對實驗結(jié)果的影響。2、整個實驗設(shè)置一個無土對照，不加土樣，其他操作與樣品實驗相同，6以檢驗試劑純度和基質(zhì)自身分解。3、如果樣品吸光值超過標(biāo)曲的最大值，則應(yīng)該增加分取倍數(shù)或減少培養(yǎng)的土樣四、結(jié)果計算：以24小時后1g土

5、壤中NH3－N的毫克數(shù)表示土壤脲酶活性（Ure）。Ure=（a樣品－a無土－a無基質(zhì)）×V×n／m式中：a樣品為樣品吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的NH3－N毫克數(shù)；a無土為無土對照吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的NH3－N毫克數(shù)；a無基質(zhì)為無基質(zhì)對照吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的NH3－N毫克數(shù)；V為顯色液體積；n為分取倍數(shù)，浸出液體積／吸取濾液體積；m表示烘干土重土壤磷酸酶活性測定（磷酸苯二鈉比色法）一、原理測定磷酸酶主要根據(jù)酶促生成的有機(jī)基團(tuán)量或無機(jī)磷量計算磷酸酶活性。前一種通常稱為有有機(jī)基團(tuán)含量法，是目前較為常用的測定磷酸酶的方法，后一種稱為無機(jī)磷含量法。研究證明：磷酸酶有三種最適PH值：4~5、6~7

6、、8~10。因此，測定酸性、中性和堿性土壤的磷酸酶，要提供相應(yīng)的PH緩沖液才能測出該土壤的磷酸酶最大活性。測定磷酸酶常用的PH緩沖體系有乙酸鹽緩沖液（PH5.0~5.4）、檸檬酸鹽緩沖液（PH7.0）、三羥甲基氨基甲烷緩沖液（PH7.0~8.5）、和硼酸緩沖液（PH9~10）。磷酸酶測定時常用基質(zhì)有磷酸苯二鈉、酚酞磷酸鈉、甘油磷酸鈉、α-或者β-萘酚磷酸鈉等?，F(xiàn)介紹磷酸苯二鈉比色法。二、試劑1）緩沖液：（1）醋酸鹽緩沖液（PH5.0）0.2mol/L醋酸溶液11.55ml95%冰醋酸溶至1L.0.2mol/L醋酸鈉溶液16.4gC2H3O2Na或27gC2H3O2Na.3H2O溶至1

7、L.取14.8ml0.2mol/L醋酸溶液和35.2ml0.2mol/L醋酸鈉溶液稀釋至1L.（2）檸檬酸鹽緩沖液（PH7.0）0.1mol/L檸檬酸溶液19.2gC6H7O8溶至1L.0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液53.63gNa2HPO4.7H2O或者71.7gNa2HPO4.12H2O溶至1L.取6.4ml0.1mol/L檸檬酸溶液加43.6ml0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液稀釋至100ml.（3）硼酸鹽緩沖液（PH9.6）0.05mol/L硼砂溶液