現(xiàn)代生化藥學(xué)課后題答案

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1、第一章PCR1PCR的英文全稱是什么?PolymeraseChainReaction2PCR是誰發(fā)明的？KaryMullis3PCR的基本原理是什么？PCR的基本工作原理是以擬擴(kuò)增的DNA片段為模板，以一對(duì)分別與模板DNA互補(bǔ)的寡核苷酸為引物，在DNA聚合酶的作用下，根據(jù)半保留復(fù)制的機(jī)制沿著模板DNA鏈延伸，直至新的DNA合成。不斷重復(fù)這一過程，則可使目的DNA片段得到擴(kuò)增。4PCR反應(yīng)的產(chǎn)物中一般會(huì)生成幾種長度不同的產(chǎn)物？反應(yīng)結(jié)束時(shí)他們的含量分別是怎樣的？PCR反應(yīng)中一般會(huì)產(chǎn)生2種不同長度的產(chǎn)物：一種是預(yù)期長度的產(chǎn)物，一種是比預(yù)期長度長得多的產(chǎn)物；前者以指數(shù)級(jí)數(shù)增加（2n），后者以幾何級(jí)數(shù)

2、增加（2n）。因此后者在總產(chǎn)物中所占比重很小，可忽略不計(jì)。5一般PCR反應(yīng)中包括幾種基本成份？它們的功能分別是什么？7種基本成分:模板,特異性引物,熱穩(wěn)定DNA聚合酶,脫氧核苷三磷酸(dNTP),二價(jià)陽離子,緩沖液及一價(jià)陽離子,石蠟油(可忽略)模板：待擴(kuò)增的DNA或RNA,甚至細(xì)胞；引物：與靶DNA的3’端和5’端特異性結(jié)合的寡核苷酸片段，是決定PCR特異性的關(guān)鍵。只有每條引物都與靶DNA特異性結(jié)合，才能保證其特異性，引物越長，特異性越高。兩段引物間的距離決定了擴(kuò)增片斷的長度；兩引物的5’端決定了擴(kuò)增產(chǎn)物的5’端位置。說明引物決定了擴(kuò)增片斷的長度、位置和結(jié)果。DNA聚合酶：a.聚合作用，將d

3、NTP中脫氧單核苷酸逐個(gè)加到3’-OH末端,b.3’-5’外切酶活性，校正功能,c.5’-3’外切酶活性，切除錯(cuò)配核苷酸；石蠟油：維持恒熱和整個(gè)體系中鹽濃度，減少PCR過程中尤其是變性時(shí)液體蒸發(fā)所造成的產(chǎn)物的丟失。6PCR反應(yīng)對(duì)模板有什么要求（種類及質(zhì)量要求等）？基因組DNA、噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA、cDNA、mRNA、預(yù)先擴(kuò)增的DNA均可作為模板。PCR反應(yīng)對(duì)模板純度要求不是很高，經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法制備的樣品即可以作為模板；但是模板中絕對(duì)不能含有蛋白酶、核酸酶、Taq酶抑制劑和任何可以結(jié)合DNA的蛋白；雖然片段長短不是影響PCR效率的關(guān)鍵因素，短片段模板PCR效率更高；為保證反應(yīng)的特

4、異性，應(yīng)使用ng級(jí)的克隆DNA、μg級(jí)的單拷貝染色體DNA、或104拷貝的待擴(kuò)增片段。7什么叫PCR的引物？什么叫特異性引物？什么叫簡并性引物？引物：所謂引物，實(shí)際上就是兩段與待擴(kuò)增靶DNA序列互補(bǔ)的寡核苷酸片段，兩引物間距離決定擴(kuò)增片段的長度，兩引物的5’端決定擴(kuò)增產(chǎn)物的5’末端位置。(引物要大大過量)特異性引物：引物是與靶DNA的3’端和5’端特異性結(jié)合的寡核苷酸片段，是決定PCR特異性的關(guān)鍵。只有當(dāng)每條引物都能特異性地與模板DNA中的靶序列復(fù)性形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，才能保證其特異性。簡并性引物：簡并引物是指代表編碼單個(gè)氨基酸所有不同堿基可能性的不同序列的混合物。為了增加特異性,可以參考密碼子

5、使用表,根據(jù)不同生物的堿基使用偏好,減少簡并性。8引物設(shè)計(jì)的基本原則有哪些？a.引物長度一般在20～24bp(≥16,≤30)：這樣長度的引物保證了不易形成雜合體；b.（G+C）%含量：兩段引物的此數(shù)值應(yīng)相近；在已知模板序列時(shí)應(yīng)與模板的相近。40%-60%c.引物本身不能形成明顯的次級(jí)結(jié)構(gòu)，如發(fā)卡結(jié)構(gòu)；d.兩引物間不可發(fā)生互補(bǔ)(特別是3’端，若不可避免那3’端互補(bǔ)堿基不可超過2個(gè)堿基)；e.引物3’端配對(duì)：引物3’端為DNA聚合酶連上寡核苷酸的地方，因此該端5-6個(gè)堿基與DNA的配對(duì)必須嚴(yán)格、準(zhǔn)確。9PCR中使用的DNA聚合酶有哪幾種，各具有哪些特點(diǎn)？a.Klenow片段：為DNA聚合酶Ⅰ的

6、片段，有聚合酶活性和3’~5’外切酶活性(最適37℃)；b.Taq酶：耐熱DNA聚合酶，可耐受93～95攝氏度(最適74-75℃)，是PCR普及的關(guān)鍵。它避免了不斷補(bǔ)加DNA聚合酶的繁瑣操作，提高了退火和延伸的溫度，減少了非特異性產(chǎn)物和DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)PCR的干擾，提高了PCR的特異性、敏感度和產(chǎn)量。它沒有3’~5’外切酶活性，無校對(duì)功能，點(diǎn)突變較多。依賴Mg2+。c.Stoffel片段：第二代耐熱DNA聚合酶，去除Taq酶的5’~3’外切酶活性，將97.5攝氏度的半衰期提高到20min，而Taq酶只有5min；對(duì)復(fù)合PCR（2個(gè)或以上模板位點(diǎn)的PCR）更有效；d.VentTMDNA多聚酶：

7、耐受100攝氏度以上高溫達(dá)2h；具有校對(duì)功能(3’~5’外切酶活性)。e.RTth逆轉(zhuǎn)錄酶：有依賴于RNA的耐熱DNA聚合酶活性和依賴于DNA的耐熱DNA聚合酶活性，這兩種活性分別依賴于Mn2+和Mg2+。10PCR反應(yīng)中對(duì)于加入的dNTP有什么要求？1）dNTP應(yīng)具有一定濃度：50-200μmol/L,不得低于10-15。濃度過高會(huì)抑制Taq酶活性，較低濃度可降低錯(cuò)誤摻入；高濃度dNTPs易產(chǎn)生錯(cuò)誤摻入，而