人參βas基因之表達(dá)調(diào)控及功能分析

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1、人參βAS基因之表達(dá)調(diào)控及功能分析第1章緒論1.1選題的目的意義人參的藥用價(jià)值在世界范圍內(nèi)被廣泛關(guān)注，其藥用價(jià)值的深入研究和活性成分的鑒定正在大量開展[3]；但由于受資源限制，植物病害嚴(yán)重，如紅膚病和根腐病等，導(dǎo)致人參栽培種植越來越困難，又因?yàn)槿藚⒃耘鄷r(shí)間長(zhǎng)(從播種開始6～7年達(dá)成熟期)，直接從人參中獲取人參皂苷的成本日趨增高[4]，傳統(tǒng)的田間種植模式已經(jīng)很難滿足日益增長(zhǎng)的人參市場(chǎng)需求；近年來，科學(xué)家通過生物技術(shù)手段來改良、培育新品種并快速大量繁殖人參種苗或利用基因工程技術(shù)建立轉(zhuǎn)基因組織、器官或植株，以滿足人參皂苷

2、生產(chǎn)需要，取得了一定成果[5-6]，但仍有一些明顯不足，如皂苷生產(chǎn)效率較低等，因此利用代謝工程來使人參皂苷得到過量生產(chǎn)，進(jìn)而提高人參皂苷生產(chǎn)效率，是一個(gè)很有前景的策略[7]。到目前為止，人參皂苷的合成途徑尚未完全明確，在人參體內(nèi)2,3-氧化角鯊烯流向三條代謝途徑，一條是合成固醇類物質(zhì)，另外兩條是合成皂苷類物質(zhì)（達(dá)瑪烷型皂苷、齊墩果烷型皂苷），達(dá)瑪烯二醇合成酶（dammarenediol-Ⅱsynthase，DS）和β-香樹素合成酶（Beta-amyrinsynthase，βAS）分別是是控制2,

3、3-氧化角鯊烯進(jìn)入兩條不同皂苷合成途徑的關(guān)鍵酶[8]；由于齊墩果烷型皂苷中只有Ro一種，而且是藥理活性很小，含量也非常小，屬于次要皂苷，因此，通常認(rèn)為人參的主要活性成分為達(dá)瑪烯二醇合成酶催化合成的達(dá)瑪烷型三萜皂苷。本研究采用RNAi技術(shù)，通過干擾人參發(fā)根中βAS基因的表達(dá)，明確β-香樹素合成酶（βAS）在人參皂苷合成中的功能作用，為進(jìn)一步揭示人參皂苷具體的合成機(jī)制奠定基礎(chǔ)；另一方面，通過干擾βAS基因，抑制藥理活性較小的齊敦果烷型人參皂苷的合成，而使代謝流向主要活性成分達(dá)瑪烷

4、型人參皂苷合成途徑，從而達(dá)到增加人參皂苷含量的目的，實(shí)現(xiàn)人參種質(zhì)創(chuàng)新；因此本研究具有廣泛的理論和現(xiàn)實(shí)意義。............1.2人參皂苷研究現(xiàn)狀人參皂苷是人參次級(jí)代謝產(chǎn)物，屬三萜皂苷；目前，研究表明人參總皂苷是由100多種人參單體皂苷組成的，根據(jù)薄層板上斑點(diǎn)的Rf值從底部到頂部的順序，人參單體皂苷被命名為RX(X=0，A-1，A-2，B-1，B-2，B-3，C，D，E，F(xiàn)，G-1，G-2，H-1，，X)[9]；同時(shí)，由于人參皂苷是糖的衍生物，主要是由糖的半縮醛羥基與非糖結(jié)合而成化合物，非糖部分稱為苷元，因此

5、，根據(jù)苷元結(jié)構(gòu)的不同，人參皂苷被分為兩大類，即達(dá)瑪烷型和齊墩果烷型[10]，其中絕大部分的單體皂苷為達(dá)瑪烷型，其基本骨架是四環(huán)；根據(jù)碳-3、-6和-20上糖基的位置的不同，以及其上邊可以是空的或與糖環(huán)相連情況的不同，達(dá)瑪烷型人參皂苷又可以被進(jìn)一步分為原人參二醇型（包括Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rg3、Rh2等）和原人參三醇型（包括Re、Rg1、Rg2、Rh1等）兩類；而齊墩果烷型人參皂苷只有一種人參皂苷Ro，其苷元是齊墩果酸，基本骨架為五環(huán)。從人參中已被分離出來的單體皂苷達(dá)40多種，包括最近從除人參根以外

6、的其他部位，如人參花蕾、加工人參、人參葉片中分離出的新型人參單體皂苷，其大部分屬于達(dá)瑪烷型；其中被研究和關(guān)注最多的人參單體皂苷有Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rg1、Rg2、Rg3、Re、Rf、Rh1和Rh2等[11]；而新發(fā)現(xiàn)的人參單體皂苷的生物活性仍有待進(jìn)一步的研究。第2章βAS基因RNAi元件的設(shè)計(jì)與構(gòu)建2.1引言人參皂苷合成關(guān)鍵酶RNAi研究的第一步就是RNAi元件的引物設(shè)計(jì)，人參中β-香樹素合成酶基因有PNY1和PNY2，構(gòu)建其RNAi元件需要對(duì)這一對(duì)基因的序列進(jìn)行比對(duì)，確定β

7、-香樹素合成酶基因編碼序列的保守區(qū)域；同時(shí)，βAS與DS，LS，CAS等其他三個(gè)關(guān)鍵酶基因的序列也是有一定的相似性的，為了增強(qiáng)βAS基因RNAi的特異性，同時(shí)避免其對(duì)其他關(guān)鍵酶基因的影響，還需要在保守區(qū)域的基礎(chǔ)上再與DS，LS，CAS關(guān)鍵酶基因進(jìn)行序列比對(duì)，以確定RNAi元件所作用的區(qū)域[61]；因此，本研究干擾元件引物的設(shè)計(jì)是通過兩次的序列比對(duì)，綜合酶切位點(diǎn)的設(shè)計(jì)，在生物信息軟件的幫助下確定其引物序列，利用重組PCR技術(shù)構(gòu)建得到人參βAS基因的RNAi元件，為下一步構(gòu)建工程菌以及人參

8、發(fā)根的遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。.............2.2材料與方法2.2.1材料MS固體培養(yǎng)基培養(yǎng)3周的人參發(fā)根，本實(shí)驗(yàn)室保存；試劑：RNA提取試劑盒，DNA膠回收試劑盒，RT-PCR相關(guān)試劑購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，PfuDNA聚合酶購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。以配制1000ml液體培養(yǎng)基為例，其余配制量根據(jù)需要同比例增加或減少。取1000