基因表達及功能分析基本策略

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1、第二十六章基因表達及功能分析的基本策略STRATEGIESFORANALYZINGGENEEXPRESSIONANDFUNCTION第一節(jié)基因表達的分析策略StrategiesforAnalyzingGeneExpression一、通過檢測mRNA揭示基因轉(zhuǎn)錄水平的表達特征根據(jù)分析方法的原理和功能特性，可將基因表達分析分為:封閉性系統(tǒng)研究方法:例如DNA微陣列、Northern印跡、實時RT-PCR等方法，其應(yīng)用范圍僅限于已測序的物種，只能研究已知的基因。開放性系統(tǒng)研究方法:如差異顯示PCR、雙向基因表達指紋圖譜、分子索引法、隨機

2、引物PCR指紋分析等，可以發(fā)現(xiàn)和分析未知的基因。這里主要針對已知基因的常用表達分析方法做一介紹。（一）基于雜交原理的方法可檢測mRNA表達水平1．Northern印跡（Northernblot）既可分析mRNA表達又可驗證cDNA新序列是一種基于RNA-DNA雜交原理建立的一種RNA分析技術(shù)Northern印跡分析原理示意圖2．核糖核酸酶保護實驗（ribonucleaseprotectionassay，RPA）可用于mRNA定量和RNA剪接分析是一種基于雜交原理分析mRNA的方法，既可對mRNA進行定量分析又可研究其結(jié)構(gòu)特征，靈敏

3、度和特異性都很高。核糖核酸酶保護實驗原理示意圖可對mRNA進行區(qū)域定位是利用雜交原理建立的組織原位mRNA檢測技術(shù)，可對細胞或組織中原位表達的mRNA進行區(qū)域定位。同時也可作為定量分析的補充。通過設(shè)計與目標mRNA堿基序列互補的寡核苷酸序列，標記后作為探針；該探針能夠特異性地與目標靶序列雜交，檢測標記信號來確定基因在組織和細胞內(nèi)表達的區(qū)位信息。雖然原位雜交在功能性方面提供的信息較少，但是該技術(shù)還是被廣泛用于組織中的基因表達分析，這是因為其較高的穩(wěn)定性、較廣泛的靶點和組織適用性。3．原位雜交（insituhybridization，

4、ISH）（二）兩種變換的聚合酶鏈式反應(yīng)是常用的mRNA檢測方法1．反轉(zhuǎn)錄PCR可用于mRNA的半定量分析反轉(zhuǎn)錄PCR（reversetranscription-PCR，RT-PCR）是一種簡單、快捷地對RNA進行定性、定量分析的方法。它是以mRNA為模板，體外擴增cDNA，再以cDNA為模板進行特定基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的PCR擴增。RT-PCR技術(shù)一般用于RNA的定性分析；如果設(shè)置陽性參照，則可對待測RNA樣品進行半定量分析。該方法適合對待測樣品進行初步篩選，目前已廣泛被實時定量PCR替代。常用于mRNA的定量分析實時定量PCR(Real

5、-timeQuantitativePolymerasechainReaction,RQ-PCR)是定量分析mRNA的最通用、最快速、最簡便的方法，該方法是對PCR反應(yīng)進行實時監(jiān)測，具有很高的靈敏度和特異性。2．實時定量PCR目前有5種技術(shù)用于實時定量PCR：其中最經(jīng)濟、簡便的技術(shù)是利用熒光染料（如SYBRGreen）與雙鏈DNA分子結(jié)合發(fā)光的特性，指示擴增產(chǎn)物的增加；其他4種方法都是以熒光染料標記的寡核苷酸為探針與正確的擴增子雜交，包括5’核酸酶法（即人們熟知的TaqManTM）、分子信標、ScropionsTM和探針雜交法，它們

6、擁有更強的特異性，可以避免對PCR后溶解曲線的需求，以及后續(xù)的Southern雜交或?qū)U增子的測序鑒定，但是成本較高。SYBRGreen實時定量PCR分析原理示意圖二、通過蛋白質(zhì)檢測揭示基因翻譯水平的表達特征Western印跡（Westernblot）是一種免疫印跡技術(shù)，其基本原理與核酸分子雜交相似，只是以偶聯(lián)標記物的抗體分子作為探針，檢測轉(zhuǎn)移到固相支持物上的蛋白質(zhì)/多肽分子。當在蛋白質(zhì)水平上檢測特定基因的表達活性時，最常用的方法就是利用Western印跡對細胞或組織的總蛋白質(zhì)中的特異蛋白質(zhì)進行定性和半定量分析。（一）采用特異抗體

7、經(jīng)Western印跡可直接測定基因編碼多肽蛋白質(zhì)樣品的制備SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜特異抗體（即第一抗體）與膜上的蛋白質(zhì)（抗原）印跡雜交再經(jīng)偶聯(lián)了可檢測標記信號的第二抗體（即抗抗體，商品試劑盒中多采用偶聯(lián)辣根過氧化物酶的Ig）最后經(jīng)與酶的底物反應(yīng)而顯影、成像，經(jīng)掃描后獲取免疫印跡信息Westernblot基本程序酶聯(lián)免疫吸附分析（Enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）也是一種建立在抗原-抗體反應(yīng)基礎(chǔ)上的蛋白質(zhì)分析基本方法。該方法不需經(jīng)電泳分離待檢樣品蛋白質(zhì)，而是預(yù)先將樣品包被在支持體上，以

8、后反應(yīng)過程與Western印跡大致相同——順序結(jié)合（即“吸附”）特異抗體（一抗）及與酶連接的第二抗體（也可預(yù)先包被抗體，“吸附”抗原），再進行酶-底物反應(yīng)。反應(yīng)后通過專門的酶標儀測定、記錄數(shù)據(jù)。（二）酶聯(lián)免疫吸附分析與Western印跡原理相似但形