自身免疫性感音神經(jīng)性聾基因治療的實(shí)驗(yàn)研究

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1、自身免疫性感音神經(jīng)性聾基因治療的實(shí)驗(yàn)研究：蔡文君，譚長強(qiáng)，李玉瑾，黃和，李霜【摘要】目的：研究以重組復(fù)制缺陷型腺病毒為載體的Fas配體（FasLigand，即FasL）基因和白細(xì)胞介素10（即IL10）基因治療實(shí)驗(yàn)性自身免疫性感音神經(jīng)性聾。方法：采用同種內(nèi)耳組織抗原加弗氏佐劑免疫豚鼠，造成自身免疫性感音神經(jīng)性聾的動(dòng)物模型28只，按配對(duì)設(shè)計(jì)將其分為4組，通過鼓階微量注射的方式，A組注入攜帶FasL基因的腺病毒（AdFasL），B組注入攜帶IL10基因的腺病毒（AdIL10），C組單純注入腺病毒（攜帶綠色熒光蛋白，即AdGFP），D組注入等

2、量的磷酸鹽緩沖液?；?qū)?d后行聽覺腦干誘發(fā)電位（ABR）測試，后取顳骨制作石蠟切片并行HE染色和光鏡觀察，每組各取兩耳行螺旋韌帶和基底膜透射電鏡觀察。每組各取3只（6耳）行免疫熒光和酶免疫組織化學(xué)試驗(yàn)，以檢測基因產(chǎn)物表達(dá)和腺病毒轉(zhuǎn)染情況。結(jié)果：免疫組織化學(xué)顯示攜帶目的基因的腺病毒可以轉(zhuǎn)染血管紋、螺旋韌帶、Corti器、螺旋神經(jīng)節(jié)、蝸軸小血管周圍及其耳蝸的骨壁等部位的細(xì)胞，并產(chǎn)生相應(yīng)的蛋白產(chǎn)物（IL10和FasL）。ABRⅢ波閾值的均值對(duì)比結(jié)果顯示，A組和B組明顯低于C組和D組。內(nèi)耳組織的免疫炎性反應(yīng)亦明顯較C組減輕。結(jié)論：重組復(fù)制缺陷型腺病毒可

3、以攜帶目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入內(nèi)耳，并在內(nèi)耳表達(dá)基因產(chǎn)物，其抑制炎癥反應(yīng)的作用可有效地減輕自身免疫性感音神經(jīng)性聾的內(nèi)耳組織免疫炎性損傷和聽覺功能障礙，有望成為治療自身免疫性感音神經(jīng)性聾新的方法和途徑?！娟P(guān)鍵詞】基因治療；自身免疫性感音神經(jīng)性聾；豚鼠1979年McCabe依據(jù)其臨床發(fā)現(xiàn)，即18例聽力障礙患者經(jīng)過免疫抑制治療后聽力有明顯改善，提出了自身免疫性感音神經(jīng)性聾(autoimmunesensorineuralhearingloss，ASNHL)的概念。之后的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，自身免疫性損害不僅可累及耳蝸，還可波及前庭，故又提出了自身免疫性內(nèi)耳?。╝utoim

4、muneinnereardisease，AIED）［12］概念。目前ASNHL的病因和發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，臨床缺乏特異性診斷方法，對(duì)于ASNHL患者的治療亦存在著一些問題，主要是采用皮質(zhì)激素或免疫抑制劑治療，雖然療效較快、較好，但該類藥物毒副作用多，而且還存在停藥后復(fù)發(fā)率較高等問題。近年來隨著分子生物學(xué)研究的深入和基因工程技術(shù)的進(jìn)展，基因治療已成為許多相關(guān)疾病治療研究方面的熱點(diǎn)和新希望。基因治療是根據(jù)特定的治療目的基因?qū)NA導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中并在其中表達(dá)。1996年Lalol·L-1pH7.4PBS中，經(jīng)研磨、凍溶、超聲粉碎、勻漿、離心（1000

5、r·min-1，5min）后取上清液，采用紫外分光光度計(jì)測定蛋白含量，分裝后低溫干燥制成CIEAgs干粉備用，保存于-80℃冰箱。1.3ASNHL動(dòng)物模型制備首次免疫每只動(dòng)物采用CIEAgs400mg·（0.4ml）-1，加等量完全弗氏佐劑，注射于右后足墊；2周后以CIEAgs200mg·（0.4ml）-1加等量不完全弗氏佐劑，注射于背部多點(diǎn)皮下；間隔2周后，再同樣強(qiáng)化免疫1次。依據(jù)聽覺誘發(fā)電位Ⅲ波的閾值升高（超過免疫前全部動(dòng)物均值加2倍標(biāo)準(zhǔn)差）和出現(xiàn)針對(duì)CIEAgs特異性抗體（ELISA法，波長490nm時(shí)A值超過免疫前全部動(dòng)物均值加2倍標(biāo)準(zhǔn)差），

6、判斷為ASNHL模型動(dòng)物制備成功［6］。1.4實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)ASNHL模型動(dòng)物共28只，按配對(duì)設(shè)計(jì)分為4組，每組7只：A、B和C組分別向鼓階內(nèi)注入攜帶FasL基因的重組腺病毒(AdFasL)、攜帶IL10基因的重組腺病毒(AdIL10)和攜帶綠色熒光蛋白的腺病毒(AdGFP)；D組(即對(duì)照組)用同樣方法僅向鼓階內(nèi)注射磷酸鹽緩沖液。1.5重組基因載體鼓階內(nèi)注射末次免疫后2周進(jìn)行。豚鼠用1%的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉（30mg·kg-1）后，在耳廓后方作一長3～4cm弧形切口，顯露聽泡，用微型電鉆打開聽泡，暴露耳蝸底轉(zhuǎn)，用針尖輕輕磨薄耳蝸鼓階側(cè)壁的骨壁

7、，鉆一針尖大小的孔，用微推進(jìn)器將小兒頭皮針的針尖（針尖斜面已打磨變小）插入鼓階，深度不超過1mm，先抽取少量（約10μl）的外淋巴液，再用微量注射機(jī)將重組腺病毒或腺病毒液緩慢（1μl·min-1）注入鼓階，A組給予AdFASL（病毒滴度為2.5×1010pfu·ml-1）20μl，B組給予AdIL10（病毒滴度為1.0×108pfu·ml-1）20μl，C組給予ADGFP（病毒滴度為1.0×109pfu·ml-1）20μl，D組給予等量的磷酸鹽緩沖液,骨蠟封閉耳蝸底轉(zhuǎn)，抗生素沖洗中耳腔3次，部分局部放置氧氟沙星明膠海綿預(yù)防感染。骨蠟封閉聽泡骨

8、孔，逐層縫合傷口。所有操作應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌原則。1.6特異性免疫反應(yīng)測試采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）測定