三葉黃合劑對小鼠細(xì)胞免疫功能影響的實驗研究

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1、三葉黃合劑對小鼠細(xì)胞免疫功能影響的實驗研究運晨霞余曉玲吳光肖健韋海宏肖艷芬黃燕王坤【摘要】　　目的探討三葉黃合劑對正常小鼠和免疫抑制小鼠細(xì)胞免疫功能的影響。方法用三葉黃合劑給正常小鼠和環(huán)磷酰胺（CTX）免疫抑制小鼠灌胃，然后用稱重法檢測小鼠胸腺、脾重量，用中性紅比色法檢測巨噬細(xì)胞活性，用RIA法檢測白細(xì)胞介素-2（IL-2）含量，用MTT法檢測NK細(xì)胞活性和T淋巴細(xì)胞增殖功能。結(jié)果三葉黃合劑對正常小鼠胸腺、脾重量和細(xì)胞免疫功能無顯著影響，對CTX的免疫抑制作用有顯著的抵抗作用，能增加免疫抑制小鼠胸腺和脾的重量，增強(qiáng)

2、巨噬細(xì)胞的吞噬作用，促進(jìn)IL-2分泌，增加NK細(xì)胞活性和T淋巴細(xì)胞增殖功能。結(jié)論三葉黃合劑對正常小鼠的細(xì)胞免疫功能無顯著影響，但能抵抗CTX對小鼠細(xì)胞免疫功能的抑制作用?！娟P(guān)鍵詞】三葉黃合劑巨噬細(xì)胞白細(xì)胞介素-2T淋巴細(xì)胞NK細(xì)胞　　三葉黃合劑是根據(jù)中醫(yī)基本理論及方劑組方原則提出的、以治療乙型肝炎病毒感染為主的自擬方（以中藥學(xué)家鄧家剛教授為首的專家組擬定），由三姐妹、葉下珠、絞股藍(lán)、黃芪、白術(shù)、田七等中草藥制成，有解毒、利濕化瘀、益氣健脾、扶正護(hù)肝之功。體外研究表明，三葉黃合劑對2215細(xì)胞分泌HBsAg和HBeA

3、g均具有一定的抑制作用〔1〕。為探索其對正?；蛎庖咭种菩∈蠹?xì)胞免疫功能有無調(diào)節(jié)作用，我們研究了三葉黃合劑對小鼠細(xì)胞免疫功能的影響?，F(xiàn)報道如下?！　?材料與儀器　　1.1動物昆明種小鼠120只，雌雄兼用，體重（20±2）g，廣西中醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供?！　?.2藥物與試劑三葉黃合劑，為三葉黃合劑水煎劑（低壓濃縮至3.3g生藥/ml），4℃冰箱保存，應(yīng)用時用蒸餾水配成所需濃度。MTT試劑盒：R＆DSYSTEMS產(chǎn)品；ConA（刀豆蛋白A），美國sigma公司產(chǎn)品；RPMI1640，美國GIBCO公司產(chǎn)品；IL-2試劑

4、盒（125I-IL-2RIA），北京北方生物技術(shù)研究所產(chǎn)品；環(huán)磷酰胺(CTX)，上海華聯(lián)制藥有限公司產(chǎn)品；YAC-1細(xì)胞株：本院藥理教研室保存；新生牛血清（NCS）：杭州四季青生物工程材料有限公司提供?！　?.3儀器MultiskanMK3型酶標(biāo)儀，美國Thermo公司產(chǎn)品；Forma311型CO2培養(yǎng)箱，美國Thermo公司；FJ-2008P型γ放射免疫計數(shù)器，西安國營二六二廠產(chǎn)品；722型分光光度計，上海第三分析儀器廠產(chǎn)品；AE260型電子天平，瑞士Mettler產(chǎn)品，B4i型離心機(jī)，美國Thermo公司產(chǎn)品。

5、　　2方法　　2.1動物分組及給藥方法實驗動物隨機(jī)分為12組，每組10只（其中6組用于檢測胸腺、脾重量和巨噬細(xì)胞吞噬功能，6組用于檢測其它指標(biāo)）。第1組為對照組，用生理鹽水灌胃，每鼠0.4ml·d-1；第2組為藥物對照組，每鼠用三葉黃合劑10g·kg-1·d-1灌胃；第3組為模型組，用生理鹽水灌胃，每鼠0.4ml·d-1，于實驗的第3，5，7天使用CTX60mg·kg-1·d-1，i.p造模；第4組為低劑量組，每鼠用三葉黃合劑5g·kg-1·d-1灌胃，CTX用法與第3組同，共10d；第5組為中劑量組，每鼠用三葉黃

6、合劑10g·kg-1·d-1灌胃，CTX用法與第3組同；第6組為高劑量組，每鼠用三葉黃合劑20g·kg-1·d-1灌胃，CTX用法與第3組同。給藥10d，末次給藥后24h內(nèi)檢測指標(biāo)?！　?.2免疫器官重量測定〔2〕末次給藥后5h脫頸椎處死小鼠，吸取腹腔液后，解剖小鼠取出胸腺和脾臟，于電子天平上稱重。免疫器官系數(shù)＝免疫器官重量(mg)∕10g體重?！　?.3巨噬細(xì)胞活性測定〔3〕末次給藥后5h脫頸椎處死小鼠，腹腔內(nèi)注入5ml冷Hank液，輕揉腹部數(shù)分鐘后剖腹，無菌吸取腹腔液，裝入含肝素的離心管中，2000r·min-

7、1離心10min，吸棄上清液，再用10％NCS-RPMI1640液5ml重懸，共2次，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×106個/ml，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μl，每個樣品做3個復(fù)孔，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4h使巨噬細(xì)胞貼壁。然后用10％NCS-RPMI1640液洗3次，每孔加0.072%中性紅100μl，37℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)4h。用PBS（pH7.4）洗3次。每孔加脫色劑（V/V：無水乙醇／冰醋酸1∶1）100μl，室溫放置1h后振蕩混勻，用酶標(biāo)儀于A530nm處測OD值。結(jié)果以3個復(fù)孔的±s表示?！　?

8、.4血清(IL-2)含量測定末次給藥后2h摘眼球取血，室溫下放置1h，3000r·min-1離心10min分離血清，用125I-IL-2RIA測定血清IL-2含量。有關(guān)操作方法按試劑盒說明書進(jìn)行?！　?.5NK細(xì)胞活性測定(MTT法)〔4〕末次給藥后5h脫頸椎處死小鼠，無菌操作取出脾臟，制備成脾細(xì)胞懸液備用。將脾細(xì)胞配成1×106／ml細(xì)胞懸液作為效應(yīng)細(xì)胞，