青蒿琥酯抑制mcf7細(xì)胞的機(jī)制探討論文

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1、青蒿琥酯抑制MCF7細(xì)胞的機(jī)制探討論文趙小波，劉明學(xué)，吳凱南，幸天勇【摘要】目的探討青蒿琥酯（Artesunate,ART）對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF7抑制作用及其機(jī)制。方法ART處理細(xì)胞3天后，采用MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖功能，觀察細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)的改變，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)bax、nm23、PA、VEGF、bcl2蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果ART對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF7的抑制作用呈明顯濃度依賴(lài)性，可導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)的改變；免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示20μmol/L青蒿琥酯作用兩種細(xì)胞72小時(shí)后.freel23，下調(diào)PA、VEGF蛋白的表達(dá)

2、，bcl2蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化。結(jié)論ART有抑制MCF7細(xì)胞增殖的作用，其機(jī)制可能與上調(diào)bax、nm23，下調(diào)PA、VEGF蛋白的表達(dá)有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】青蒿琥酯bax;nm23PA;VEGF;bcl2EffectsofArtesunateandItsMechanismonMCF7Cells1.DepartmentofGeneralSurgery,TheAffiliatedHospitalofNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000,China;2.DepartmentofGen

3、eralSurgery,TheAffiliatedHospitalofChongqingUniversityofMedicalscienceKey23;PA;VEGF;bcl2近年，中藥在提高癌癥患者的生存質(zhì)量和延長(zhǎng)生存期等方面對(duì)乳腺癌治療的發(fā)展帶來(lái)了新的契機(jī)?？汞懰幥噍镧ィˋRT）是青蒿素衍生物，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)對(duì)肝癌細(xì)胞有誘導(dǎo)凋亡的作用1，2,對(duì)結(jié)腸癌等55種細(xì)胞株均有細(xì)胞毒作用3。國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)ART對(duì)人乳腺癌細(xì)胞影響的相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用ER陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞株MCF7為研究對(duì)象，探討ART抑制乳腺癌細(xì)胞作用及其機(jī)制

4、，為進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。1材料與方法1.1藥物、試劑及其配置1.1.1藥物ART由廣西桂林第二制藥廠生產(chǎn)。60mgART由5%碳酸氫鈉1ml配成儲(chǔ)備液，-20℃保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)用1640液稀釋所需濃度，碳酸氫鈉的終濃度＜0.09%。1.1.2試劑RPMI1640（購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司），10%小牛血清（購(gòu)于杭州四季青生物工程材料有限公司）,80mg/L青霉素及120mg/L鏈霉素（購(gòu)于重慶醫(yī)大附一院藥房），MTT（購(gòu)于Sigma公司）。1.2細(xì)胞培養(yǎng)與處理MCF7購(gòu)于中科院上海生物研究所細(xì)胞庫(kù)。用含10%小牛血清

5、的1640培養(yǎng)基，在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2孵箱中常規(guī)培養(yǎng)傳代。細(xì)胞長(zhǎng)至瓶底80%～90%時(shí)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用0.05%胰酶—0.02%EDTA消化后，5min800轉(zhuǎn)離心，棄上清液，1640培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液即可備用。1.3MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖功能1.3.1實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分為九組：空白對(duì)照組、細(xì)胞對(duì)照組、溶劑對(duì)照組（0.09%NaHCO3）、藥物組（2μmol/L、4μmol/L、6μmol/L、8μmol/L、10μmol/L、20μmol/L）。1.3.2步驟將5.0×104/ml濃度細(xì)胞加入96孔板中，2

6、00μl/孔。培養(yǎng)24h后，細(xì)胞貼壁，分別加入不同處理因素。每組設(shè)八個(gè)平行孔，在額定的時(shí)間取出培養(yǎng)板，吸去各孔培養(yǎng)液，換上200μl無(wú)血清1640并加入20μl的MTT（5mg/ml）,輕振培養(yǎng)板，放回CO2孵箱中再培養(yǎng)4h后，10min4000轉(zhuǎn)離心，棄上清液，加DMSO200μl/孔,振蕩器上振蕩5～10min，空白調(diào)零，在微量板讀數(shù)儀中測(cè)出每孔中600nm處的OD值。并計(jì)算出ART對(duì)乳腺癌細(xì)胞的抑制率，重復(fù)3次。乳腺癌細(xì)胞存活率=抗癌藥物組吸光度值/細(xì)胞對(duì)照組吸光度值×100%乳腺癌細(xì)胞抑制率=1-乳腺癌細(xì)胞存活率1

7、.4形態(tài)學(xué)觀察20μmol/LART處理細(xì)胞3d后，細(xì)胞HE染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察。1.5免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)1.5.1步驟細(xì)胞爬片用PBS洗兩次。過(guò)氧化氫孵育10min，TritonX100/PBS穿孔，1%胰酶37℃消化30min，PBS沖洗后，滴加試劑1（正常三陽(yáng)血清）封閉無(wú)關(guān)抗原，室溫孵育10～15min，滴加適當(dāng)一抗工作液，4℃冰箱過(guò)夜，滴加生物素二抗，室溫孵育，滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素，DAB顯色，復(fù)染，酸酒精褪色后封片。1.5.2判斷標(biāo)準(zhǔn)參照Lessey等4判斷標(biāo)準(zhǔn)，陽(yáng)性細(xì)胞染成棕黃色，用HSCORE

8、系數(shù)作半定量評(píng)分。計(jì)算出100個(gè)細(xì)胞中各強(qiáng)度的百分比，求HSCORE的值，并取其平均值。1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)采用SPSS10.0軟件包進(jìn)行方差分析。2結(jié)果2.1MTT比色法結(jié)果細(xì)胞對(duì)照組與NaHCO3組的吸光度值之間無(wú)顯著性差異，說(shuō)明溶劑NaHCO3液對(duì)MCF7細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)影響。ART對(duì)MCF7細(xì)胞有