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《可誘導表達腦啡肽的大鼠星形膠質(zhì)細胞株的構建論文》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在學術論文-天天文庫。
1、可誘導表達腦啡肽的大鼠星形膠質(zhì)細胞株的構建論文徐穎,田玉科,田學愎,梅偉,安珂,楊輝【關鍵詞】可誘Constructionofanimmortalizedratastrocytestrainmortalizedratastrocytestrain(IAST)expressingenkephalinregulatedbyDoxycycline.METHODS:Humanpreproenkephalingene(hPPE)idpRevTREtoconstructrebinantretroviralvectorpRevTRE/hPPE.pRevTetOnandpRevTRE/hPPEid
2、.OneIAST/TetOnclonemunocytochemistryandindirectimmunofluorescencestaining.RESULTS:ArebinantretroviralvectorpRevTRE/hPPEultipleoftheIAST/TetOncellstrainmunocytochemistryconfirmedthatenkephalinexpressionlevelanner.CONCLUSION:AnIASTanpreproenkephalin;geneexpressionregulation;polyomavirustransform
3、ing;astrocyte【摘要】目的：構建受強力霉素誘導表達腦啡肽的大鼠星形膠質(zhì)細胞株（IAST）.方法：應用分子克隆技術構建含人前腦啡肽原基因（hPPE)的逆轉錄病毒四環(huán)素反應質(zhì)粒（pRevTRE/hPPE）；以脂質(zhì)體轉染法將重組質(zhì)粒pRevTRE/hPPE和調(diào)節(jié)質(zhì)粒pRevTetOn分別轉染入包裝細胞PT67,分別收集病毒上清；將含有RevTetOn病毒上清感染IAST,挑選單克隆并瞬時轉染報告質(zhì)粒pRevTRELuc,通過檢測螢光素酶活性,挑選出強力霉素誘導表達高、背景表達低IAST/TetOn細胞株；再將RevTRE/hPPE病毒上清感染IAST/TetOn細胞株,得到穩(wěn)
4、定表達腦啡肽的IAST/TetOn/hPPE細胞株,.freelmortalizedratastrocytestrain,IAST）,并在體外觀察強力霉素對腦啡肽表達的定量調(diào)節(jié).1材料和方法1.1材料原代培養(yǎng)的永生化IAST系本實驗室構建［4］.逆轉錄病毒載體RevTetOn系統(tǒng)（包括調(diào)節(jié)質(zhì)粒pRevTeton、反應質(zhì)粒pRevTRE、報告基因pRevTRELuc、包裝細胞PT67，Tet系統(tǒng)專用血清）購自Clontech公司；表達載體pCMVhPPE(含目的基因hPPE)由美國學者為Invitrogen公司產(chǎn)品.MMLVReverseTranscriptase逆轉錄酶及螢光素酶分
5、析試劑盒購自Promega公司.亮氨酸腦啡肽多克隆抗體購自美國Chemicon公司.螢光發(fā)光計TD20/20為TurnerBiosystem公司產(chǎn)品.1.2方法1.2.1可調(diào)控逆轉錄病毒表達載體的構建根據(jù)GenBank中hPPE基因序列(No：AH005276)及pRevTRE多克隆位點設計一對引物,引物兩端分別帶有BamHⅠ,HindⅢ酶切位點.上游引物：5′CGGATCCTCCTCAGTGGACGTT3′（含有BamHⅠ酶切位點）；下游引物CCAAGCTTAACACCATCAACAGTT3′（含有HindⅢ酶切位點）.以表達載體pCMV/hPPE為模板PCR擴增hPPE基因片段
6、.瓊脂糖電泳PCR擴增產(chǎn)物,凝膠回收950bp的hPPE基因片段,用BamHⅠ，HindⅢ雙酶切后,與BamHⅠ，HindⅢ線性化的載體pRevTRE連接,獲得重組逆轉錄病毒載體pRevTRE/hPPE,轉化感受態(tài)大腸桿菌DH5α,挑選陽性菌落,提取質(zhì)粒DNA,經(jīng)PCR、酶切分析及DNA序列測定鑒定.1.2.2逆轉錄病毒載體的包裝脂質(zhì)體（lipofectamine）介導分別將質(zhì)粒pRevTRE/hPPE，pRevTetOn轉染逆轉錄病毒包裝細胞PT67.質(zhì)粒pRevTeton含有新霉素抗性基因（Neo）,經(jīng)G418（500mg/L）篩選后,獲得穩(wěn)定產(chǎn)生RevTeton病毒的包裝細胞
7、系PT67RevTeton；質(zhì)粒pRevTRE/hPPE含有潮霉素抗性基因（Hyg）,經(jīng)潮霉素(500mg/L)篩選后,獲得穩(wěn)定產(chǎn)生RevTRE/hPPE病毒的包裝細胞系PT67RevTRE/hPPE.1.2.3螢光素酶活性檢測將含有RevTeton病毒上清感染IAST細胞株,經(jīng)G418(500mg/L)篩選后得到抗性克隆,采用有限稀釋法挑選單克隆,共形成48個單細胞克隆,命名為IAST/TetOn,分別編號為No.1～No.48.報告質(zhì)粒pRevTRELuc和pCM
