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《可誘導表達腦啡肽的大鼠星形膠質(zhì)細胞株的構(gòu)建》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學術(shù)論文-天天文庫。
1、可誘導表達腦啡肽的大鼠星形膠質(zhì)細胞株的構(gòu)建作者：徐穎,田玉科,田學愎,梅偉,安珂,楊輝【關(guān)鍵詞】可誘Constructionofanimmortalizedratastrocytestrainmortalizedratastrocytestrain(IAST)expressingenkephalinregulatedbyDoxycycline.METHODS:Humanpreproenkephalingene(hPPE)idpRevTREtoconstructrebinantretroviralvectorpRevTRE/hPPE.pRevTetOnandpR
2、evTRE/hPPEid.OneIAST/TetOnclonemunocytochemistryandindirectimmunofluorescencestaining.RESULTS:ArebinantretroviralvectorpRevTRE/hPPEultipleoftheIAST/TetOncellstrainmunocytochemistryconfirmedthatenkephalinexpressionlevelanner.CONCLUSION:AnIASTanpreproenkephalin;geneexpressionregulatio
3、n;polyomavirustransforming;astrocyte【摘要】目的：構(gòu)建受強力霉素誘導表達腦啡肽的大鼠星形膠質(zhì)細胞株（IAST）.方法：應用分子克隆技術(shù)構(gòu)建含人前腦啡肽原基因（hPPE)的逆轉(zhuǎn)錄病毒四環(huán)素反應質(zhì)粒（pRevTRE/hPPE）；以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒pRevTRE/hPPE和調(diào)節(jié)質(zhì)粒pRevTetOn分別轉(zhuǎn)染入包裝細胞PT67,分別收集病毒上清；將含有RevTetOn病毒上清感染IAST,挑選單克隆并瞬時轉(zhuǎn)染報告質(zhì)粒pRevTRELuc,通過檢測螢光素酶活性,挑選出強力霉素誘導表達高、背景表達低IAST/TetOn細胞株；再將
4、RevTRE/hPPE病毒上清感染IAST/TetOn細胞株,得到穩(wěn)定表達腦啡肽的IAST/TetOn/hPPE細胞株,通過RTPCR、免疫細胞化學及間接免疫熒光染色檢測該細胞株中強力霉素定量調(diào)控腦啡肽的表達.結(jié)果：重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pRevTRE/hPPE構(gòu)建成功；經(jīng)挑選得到了高表達、低背景IAST/TetOn細胞株,其誘導倍數(shù)為20.6；在IAST/TetOn/hPPE細胞株中,hPPE基因表達受強力霉素調(diào)控,呈劑量依賴關(guān)系.結(jié)論：成功構(gòu)建了受四環(huán)素及其衍生物強力霉素定量調(diào)控表達腦啡肽的永生化IAST,為可調(diào)控基因治療慢性疼痛的研究奠定了基礎(chǔ).【關(guān)鍵詞】人
5、前腦啡肽；基因表達調(diào)控；多瘤病毒轉(zhuǎn)化；星形膠質(zhì)細胞0引言轉(zhuǎn)基因細胞移植鎮(zhèn)痛為慢性疼痛的治療開辟了新領(lǐng)域［1］,但傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因鎮(zhèn)痛模式不能調(diào)控鎮(zhèn)痛物質(zhì)的分泌,外源鎮(zhèn)痛基因在宿主體內(nèi)持續(xù)表達可帶來諸多不良后果.TetOn基因調(diào)控系統(tǒng)通過四環(huán)素及其衍生物強力霉素來調(diào)節(jié)目的基因的定量表達,是在分子水平精確調(diào)控外源基因表達的較好工具［2-3］.為安全有效實施轉(zhuǎn)基因鎮(zhèn)痛,我們擬運用逆轉(zhuǎn)錄病毒四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng),建立可誘導表達腦啡肽的大鼠星形膠質(zhì)細胞株（immortalizedratastrocytestrain,IAST）,并在體外觀察強力霉素對腦啡肽表達的定量調(diào)節(jié).1材料和
6、方法1.1材料原代培養(yǎng)的永生化IAST系本實驗室構(gòu)建［4］.逆轉(zhuǎn)錄病毒載體RevTetOn系統(tǒng)（包括調(diào)節(jié)質(zhì)粒pRevTeton、反應質(zhì)粒pRevTRE、報告基因pRevTRELuc、包裝細胞PT67，Tet系統(tǒng)專用血清）購自Clontech公司；表達載體pCMVhPPE(含目的基因hPPE)由美國學者為Invitrogen公司產(chǎn)品.MMLVReverseTranscriptase逆轉(zhuǎn)錄酶及螢光素酶分析試劑盒購自Promega公司.亮氨酸腦啡肽多克隆抗體購自美國Chemicon公司.螢光發(fā)光計TD20/20為TurnerBiosystem公司產(chǎn)品.1.2方法1.
7、2.1可調(diào)控逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體的構(gòu)建根據(jù)GenBank中hPPE基因序列(No：AH005276)及pRevTRE多克隆位點設(shè)計一對引物,引物兩端分別帶有BamHⅠ,HindⅢ酶切位點.上游引物：5′CGGATCCTCCTCAGTGGACGTT3′（含有BamHⅠ酶切位點）；下游引物CCAAGCTTAACACCATCAACAGTT3′（含有HindⅢ酶切位點）.以表達載體pCMV/hPPE為模板PCR擴增hPPE基因片段.瓊脂糖電泳PCR擴增產(chǎn)物,凝膠回收950bp的hPPE基因片段,用BamHⅠ，HindⅢ雙酶切后,與BamHⅠ，HindⅢ線性化的載體pRe
8、vTRE連接,獲得重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體p
