復(fù)合人工骨對(duì)兔骨缺損的修復(fù)作用

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1、復(fù)合人工骨對(duì)兔骨缺損的修復(fù)作用　　骨髓基質(zhì)干細(xì)胞作為一類未分化的細(xì)胞，其具有自我復(fù)制能力，能夠分化成為至少一種功能細(xì)胞的早期未分化細(xì)胞[1].目前絕大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，組織工程包含的三個(gè)核心因素是：干細(xì)胞，適合的生物支架和生長(zhǎng)因子。骨組織工程的先決條件是有足量的成骨潛能的細(xì)胞。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞具有以下特點(diǎn)：（1）具有向多種組織類型分化的潛能，可以在體外大量擴(kuò)增；（2）取材方便且對(duì)機(jī)體損害輕微，在進(jìn)行移植時(shí)由它誘導(dǎo)的組織不存在免疫排斥和組織配型反應(yīng)[2];（3）植入外源性基因不影響其生理特性，所以它成為當(dāng)今骨組織工程的最

2、理想種子細(xì)胞。由于綠色熒光蛋白分子相對(duì)較?。?619kD），可以與很多蛋白融合表達(dá)而對(duì)各自性質(zhì)的特性幾乎沒有影響，因而利用標(biāo)準(zhǔn)亞克隆技術(shù)即可將感興趣的基因與GFP融合后轉(zhuǎn)入感興趣的生物體內(nèi)進(jìn)行瞬間或穩(wěn)定表達(dá)，這樣可進(jìn)行細(xì)胞間的物質(zhì)運(yùn)輸、運(yùn)輸?shù)膭?dòng)力、活體定位觀察及蛋白質(zhì)定位學(xué)的研究[3].本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)體外培養(yǎng)兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，體外轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白，證明其在正常細(xì)胞中可存活。我們建立了一種復(fù)合骨組織人工骨的材料，同時(shí)采用骨組織工程復(fù)合材料學(xué)方法，以異體骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（MesenchymalstemcellsMSCs）

3、為種子細(xì)胞，制成細(xì)胞-載體復(fù)合物，用來(lái)修復(fù)兔橈骨骨缺損，檢查修復(fù)情況?！　?資料和方法?！　?.1一般資料。BM-Ⅱ型水浴式生物組織包埋機(jī)（Olmpus,日本），1512型組織切片機(jī)（K-08,山東濰坊醫(yī)療器械廠，濰坊），水浴式自動(dòng)恒溫?cái)偲鳎═D5A-odifiedtetrachrome染液。　　1.2試驗(yàn)動(dòng)物分組選用健康成年中國(guó)大白兔72只，重2.0~2.5kg,雄雌不限，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組（A組），對(duì)照組（B,C組），每組24只。A組行同種異體骨髓基質(zhì)干細(xì)胞骨移植，B組行自體骨移植，C組行空白支架?！　?.3手

4、術(shù)方法速眠新5ml/kg耳緣靜脈麻醉后，仰臥位固定，術(shù)區(qū)剪毛，碘伏酒精消毒，鋪洞巾。取右側(cè)前肢中段橈側(cè)骨凸起處做約3.0cm縱形切口，逐層切開，保護(hù)血管、分離軟組織后顯露橈骨。在距橈骨遠(yuǎn)端2.0cm處用線鋸截?cái)鄻锕?，再向近端距?截骨線1.0cm處做第2截骨線，切除1.0cm骨段，A組植入同種異體基質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合物、B組原位植入自體骨，C組植入支架，徹底止血、沖洗后依次縫合筋膜與皮膚，無(wú)菌敷料繃帶包扎。術(shù)后肌注青霉素針劑每次50萬(wàn)單位，1次/d,連續(xù)5d,在相同條件下用標(biāo)準(zhǔn)飼料分籠飼養(yǎng)。由于兔前肢的上下尺橈關(guān)節(jié)先天

5、性骨性融合，橈骨離斷后尺骨可發(fā)揮很好的支撐作用，故骨折端穩(wěn)定性好，不需要內(nèi)外固定。術(shù)后4周、8周、12周分批取材進(jìn)行拉伸應(yīng)力實(shí)驗(yàn)、X線片和HE染色以及內(nèi)源性BMP-2表達(dá)情況的檢查，然后作對(duì)比分析?！　?.4標(biāo)本處理。分別于術(shù)后4、8、12周分3批，每組各隨機(jī)抽取8只動(dòng)物，先行拍攝X線片，然后用氣體栓塞法處死，于右側(cè)前肢橈骨骨折端取材（切取以骨折端為中心2cm的骨段）。肉眼大體觀察后用生理鹽水沖洗，立即置于4%多聚甲醛溶液，在室溫下固定24~48h.置于福爾馬林100ml、生理鹽水800ml、甲酸70ml、鹽酸8

6、0ml、三氯化鋁60g、乙酸25ml配成的混合脫鈣液中1周，至脫鈣滿意后，梯度酒精脫水，叔丁醇透明，石蠟包埋，5μm厚度組織切片，行HE染色及免疫組織化學(xué)染色觀察?！　?.5放射學(xué)檢查每只動(dòng)物均由專人負(fù)責(zé)拍攝右側(cè)前肢正側(cè)位X線片，進(jìn)行觀察和對(duì)比。攝片條件：30mA、50kV、0.05S[6].　　1.6拉伸應(yīng)力實(shí)驗(yàn)。國(guó)標(biāo)拉力機(jī)下行10mm/s拉伸實(shí)驗(yàn)，記錄產(chǎn)生斷裂時(shí)的最大拉力值，然后將各組進(jìn)行比較?！　?.7光鏡觀察。光鏡下觀察HE染色切片，比對(duì)組織學(xué)變化?！　?.8免疫組化觀察。比較3組生物因子BMP-2

7、表達(dá)情況。生物因子的表達(dá)情況經(jīng)計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)處理后用平均灰度值來(lái)表示?！　?.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理平均灰度值用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS14.0進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，3組比較，P<0.05.　　2結(jié)果?！　?.1放射學(xué)檢查?！　?shí)驗(yàn)A組：術(shù)后4周時(shí)骨缺損處有低密度組織陰影出現(xiàn)，骨折端有新生骨痂出現(xiàn)；術(shù)后8周骨痂量增多，且其骨密度增加，部分骨缺損已經(jīng)達(dá)到臨床愈合；術(shù)后12周骨痂量明顯增多，且密度接近正常骨密度，出現(xiàn)骨髓腔結(jié)構(gòu)，髓腔再通。　　對(duì)照B組：術(shù)后4周時(shí)骨折端有低密度組織陰影出現(xiàn)骨折端有新生骨痂出現(xiàn)，

8、骨折線明顯模糊；術(shù)后8周骨痂量增多，且其骨密度增加密度接近正常骨密度，出現(xiàn)骨髓腔結(jié)構(gòu)；術(shù)后12周已經(jīng)達(dá)到臨床骨愈合，髓腔再通。對(duì)照C組：術(shù)后4周時(shí)無(wú)骨痂形成，骨折邊緣光滑；術(shù)后8周骨折邊緣趨向模糊，無(wú)明顯骨痂形成；術(shù)后12周骨折邊緣模糊，少量骨痂形成。共2頁(yè):12　　2.2拉伸應(yīng)力實(shí)驗(yàn)?！　「鹘M在10mm/s的速度下，斷裂時(shí)所承受的拉力值，見表1,用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)軟