無血清培養(yǎng)基與完全培養(yǎng)基體外誘導擴增 cik細胞

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1、無血清培養(yǎng)基與完全培養(yǎng)基體外誘導擴增CIK細胞【摘要】目的比較無血清培養(yǎng)基（AIMV）與完全培養(yǎng)基（CM）體外誘導擴增CIK細胞及CIK細胞分泌細胞因子水平。方法分別用AIMV及完全培養(yǎng)基加入4種細胞因子(IFNγ、IL2、IL1及OKT3)將臍帶血單個核細胞(CBMNCs)誘導成CIK細胞，比較細胞的增殖能力、細胞表型及分泌細胞因子水平。結果與完全培養(yǎng)基比較，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的CIK細胞增殖高峰較晚(14～17天),但增殖倍數高，在細胞表型、分泌細胞因子水平方面兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)的CIK細胞均無明顯的差別（P＞0.05）。結論無血清培養(yǎng)基可代替完全培養(yǎng)基?！娟P鍵詞】無血清培養(yǎng)

2、基免疫細胞培養(yǎng)細胞因子腫瘤0引言CIK細胞（Cytokineinducedkiller，CIK）是將人外周血單個核細胞，在體外用多種細胞因子（如IFNγ、IL2、IL1及OKT3等）共同培養(yǎng)一段時間后獲得的一群異質細胞。具有極強的增殖能力及殺傷腫瘤細胞的能力。Critzapis等[1]報道，CIK細胞分泌多種細胞因子進一步提高免疫效應細胞的細胞毒作用從而殺傷腫瘤細胞。治療所需的CIK細胞在體外培養(yǎng)時所用的條件對細胞的活性有很大影響?，F在常用于細胞培養(yǎng)的完全培養(yǎng)基,因含有人AB血清,雖經HBV、HCV及HIV的檢測,但仍有可能傳播其他疾病,安全性低;并且存在批次差異、不宜質

3、控，質量不能保證。無血清培養(yǎng)基則可達到生物潔凈要求,成分明確,質量穩(wěn)定,便于質控,克服了人ＡＢ血清的缺點,能減少病人意外感染的機會，對于免疫治療的推廣應用有重要意義。為此,我們比較了無血清培養(yǎng)基（ＡＩＭＶ）與完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清RPMI1640)培養(yǎng)CIK細胞分泌細胞因子水平。1材料與方法1.1材料健康足月產胎兒臍帶靜脈血50ml(枸櫞酸鈉抗凝),產婦各項生化指標檢測正常。RPMI1640培養(yǎng)基、淋巴細胞分離液和無血清培養(yǎng)基購自GIBCO公司,細胞因子購自Bioscience公司,流式試劑CD45FITC/CD4PE/CD8ECD/CD3PC5、CD3FITCC

4、D16+CD56PE和PI染液購自BeckmanColuter公司，胎牛血清購自美國Hyclone公司。1.2方法1.2.1細胞培養(yǎng)臍血用淋巴細胞分離液作密度梯度2500r/min離心30min分離的外周血單個核細胞,分別用完全培養(yǎng)基(RPMI1640,含10%胎牛血清,100μｇ/ｍｌ鏈霉素,100Ｕ/ｍｌ青霉素)和無血清培養(yǎng)基調整細胞數為1×106個/ml,接種于24孔培養(yǎng)板,930μl/孔。第1天加入rhIFNγ1000u/ml,培養(yǎng)24h后加入rhIL2300u/ml、rhIL1100u/ml及OKT350ng/ml繼續(xù)培養(yǎng),每隔4d更換培養(yǎng)基,調細胞數為1×1

5、06個/ml,補加rhIL2300u/ml,每8d在補加rhIL2的同時補加OKT350ng/ml。YTMLC、GLC和A549用含10%的胎牛血清、100u/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的RPMI1640常規(guī)培養(yǎng)。設不加細胞因子的CBMNCs培養(yǎng)作為對照。1.2.2細胞表型分析于培養(yǎng)的第0、4、8、10、12、14、17、21d對以上各組效應細胞進行分析,每組每次測4個復孔。1.2.3細胞增殖能力測定于培養(yǎng)的第0、4、8、10、12、14、17、21d分別取細胞用臺盼藍拒染法計數所培養(yǎng)的活細胞濃度,根據流式檢測的CIK的比例，計量液量,推算CIK細胞總數。1.2.4C

6、IK細胞分泌IL2、IFNγ、TNFα細胞因子水平測定于培養(yǎng)的第0、4、8、10、12、14、17、21d分別取細胞,充分洗滌,調整細胞濃度為2×106/ml培養(yǎng)24ｈ后,收集上清,用ＥＬＩＳＡ法定量測定細胞培養(yǎng)上清中IL2、IFNγ、TNFα，設4個平行孔。2結果2.1ＡＩＭＶ與完全培養(yǎng)基培養(yǎng)CIK細胞增殖能力的比較實驗表明,ＡＩＭＶ培養(yǎng)細胞較完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞增殖遲緩。完全培養(yǎng)基增殖高峰期在第12d，增殖平臺為第10～12d，最高增殖倍數為638.4倍；而ＡＩＭＶ培養(yǎng)基增殖高峰期在第14d，增殖平臺為第14～17d，最高增殖倍數為678.7倍。雖然ＡＩＭＶ培養(yǎng)細胞

7、較完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞增殖遲緩，但其增殖平臺期較長，增殖倍數較完全培養(yǎng)基高，見圖1。圖1AIMV與完全培養(yǎng)基培養(yǎng)CIK細胞增殖能力2.2ＡＩＭＶ與完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞表型比較實驗結果表明，兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞CD3+、CD8+、CD3+CD56+細胞所占百分比逐漸增多，CD3+CD56+細胞在ＡＩＭＶ培養(yǎng)基中，增長高峰在14～17d，所占相對百分率由（0.21±0.04）上升為（31.53±1.65）,增長了150.14倍，完全培養(yǎng)基增長高峰在12～14d，所占相對百分率由（0.21