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1、細(xì)菌內(nèi)同源重組快速構(gòu)建和制備表達(dá)hSDF論文唐俊明,郭凌鄖,孔霞,楊建業(yè),潘國(guó)棟,陳龍,黃永章,王家寧【關(guān)鍵詞】同源重組；人基質(zhì)細(xì)胞源衍生因子ConstructionofrebinantadenoviralplasmidbearinghSDF1αcDNAbyhomologousrebinationinbacteriaandpreparationofrebinantadenovirusexpressinghSDF1α【Abstract】AIM：ToconstructrebinantadenoviralplasmidcontaininghSDF1
2、αcDNAusinghomologousrebinationinbacteriaandtopreparerebinantadenovirusexpressinghSDF1α.METHODS:AdenoviralbackboneplasmidedintopetentBJ5183andthepetentBJ5183transformedideIdigestionandCIAPdephosphorylationedintothepetentcellsBJ5183transformedidpAdEGFPhSDF1αeLipoVectopackager
3、ebinantadenovirusAdEGFPhSDF1.AdEGFPhSDF1αedintopetentBJ5183transformedologousrebinationbetemediatedtransfectionofpAdEGFPhSDF1αdigesteded.ThepackagingofrebinantadenovirusAdEGFPhSDF1αedbyfluorescentmicroscopy.Theviraltiterpleandrapidhomologousrebinationinbacteria.Thisstudypro
4、videsabasisforexploringthemigrationmechanismofbonemarrocellsintoinjuredtissuesuchasinfarctedmyocardium.【Keyologousrebination；hSDF1α；adenovirus；genetherapy【摘要】目的：利用細(xì)菌內(nèi)同源重組快速構(gòu)建攜帶hSDF1αcDNA重組腺病毒質(zhì)粒和制備表達(dá)hSDF1α重組腺病毒.方法：制備感受態(tài)BJ5183，將pAdEasy1轉(zhuǎn)化BJ5183，制備含pAdEasy1的BJ5183感受態(tài)，將線性化的pShu
5、ttleEGFPhSDF1α轉(zhuǎn)化含pAdEasy1的BJ5183感受態(tài)菌.采用細(xì)菌中同源重組法構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒pAdEGFPhSDF1α.pAdEGFPhSDF1α用PacI線性化后，再用LipoVec介導(dǎo)其轉(zhuǎn)染至AD293細(xì)胞內(nèi)包裝擴(kuò)增出重組腺病毒顆粒，采用CsCl密度梯度離心法純化重組腺病毒AdEGFPhSDF1α.采用熒光顯微鏡下觀察LipoVec介導(dǎo)的重組腺病毒質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效果及病毒包裝情況.結(jié)果：pShuttleEGFPhSDF1α成功地轉(zhuǎn)化了含pAdEasy1的BJ5183，并在其內(nèi)發(fā)生了同源重組.熒光顯微鏡下觀察證實(shí)了pAdEG
6、FPhSDF1α轉(zhuǎn)染AD293后，產(chǎn)生了重組腺病毒AdEGFPhSDF1α.病毒滴度為4.1×1015pfu/L.結(jié)論：用細(xì)菌內(nèi)同源重組法可快速、高效制備表達(dá)hSDF1α的高滴度重組腺病毒.為研究hSDF1α在動(dòng)員骨髓源干細(xì)胞遷移到組織損傷部位修復(fù)組織損傷的研究奠定了基礎(chǔ).【關(guān)鍵詞】同源重組；人基質(zhì)細(xì)胞源衍生因子1；腺病毒；基因治療0引言基質(zhì)細(xì)胞源衍生因子1(stromalderivedfactor1,SDF1)屬CXC型趨化因子.同基因編碼兩種蛋白:SDF1α和SDF1β,其受體CXC型趨化因子受體4（CXCchemokinerecepto
7、r4,CXCR4）是一個(gè)具有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的G蛋白耦聯(lián)的受體［1］.研究發(fā)現(xiàn)SDF1α是CD34+造血干細(xì)胞的趨化因子,CD34+造血干細(xì)胞能沿SDF1濃度梯度向骨髓遷移實(shí)現(xiàn)歸巢［1-3］.同時(shí),SDF1在骨髓動(dòng)員中也發(fā)揮了重要作用［4-6］.而已知骨髓內(nèi)除了含有造血干細(xì)胞外,.freelega公司；DH5a由鄖陽(yáng)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)研究所保存;②限制性內(nèi)切酶：EcoRV，XhoI，PacI和PmeI購(gòu)自Nearker,200bpDNAladder,dNTP,Taq酶、T4DNA連接酶購(gòu)自華美生物工程公司；hSDF1αcDNA擴(kuò)增引物：上游引物為5
8、′GATATCATGAACGCCAAGGTCGTGGTC3′,下游引物為5′CTCGAGTTACTTGTTTAAAGCTTTCTC3′由北京賽百盛生物公司設(shè)計(jì)合成,
