細(xì)菌內(nèi)同源重組構(gòu)建攜帶人dmt1基因的重組腺病毒

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1、細(xì)菌內(nèi)同源重組構(gòu)建攜帶人DMT1基因的重組腺病毒【摘要】　　目的利用細(xì)菌內(nèi)同源重組法構(gòu)建攜帶二價金屬離子轉(zhuǎn)運蛋白1（DMT1）編碼基因的重組腺病毒。方法應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）從人胚近段小腸中獲取人的全長DMT1IRE的cDNA，亞克隆至腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrackCMV中，形成轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pAdTrackCMVDMT1IRE,在感受態(tài)大腸桿菌BJ5183內(nèi)與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy1同源重組，利用卡那霉素抗性平板初步篩選重組質(zhì)粒陽性克隆，經(jīng)PacⅠ酶切鑒定和PCR鑒定獲得到重組腺

2、病毒載體pAdEasy1DMT1IRE。線性化的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，獲得高滴度的重組腺病毒。結(jié)果RTPCR反應(yīng)擴增出1841bp的片段，重組質(zhì)粒陽性克隆pAdEasy1DMT1IRE經(jīng)PacⅠ酶切后獲得一大于20kb的大片段和4.5kb的特征性片段，PCR鑒定擴增出DMT1的片段，證明重組腺病毒質(zhì)粒中已成功插入目的基因DMT1IRE。轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后細(xì)胞表達(dá)GFP熒光，顯示293細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)外源性的DMT1IRE基因。結(jié)論攜帶DMT1IRE基因的重組腺病毒質(zhì)粒構(gòu)建成功，獲得高滴度的

3、重組腺病毒，為DMT1基因進(jìn)一步功能的研究提供基礎(chǔ)。【關(guān)鍵詞】陽離子轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)類重組遺傳腺病毒科　?。跘BSTRACT］ObjectiveToconstructarebinantadenoviruscontaininggeneofDMT1idpAdTrackCMVcontaininggreenfluorescentprotein(GFP)reportergene,folloidpAdTrackCMVDMT1IREbyPmeⅠdigestionandsubsequentcotransformation

4、intoE.coliBJ5183cellsalongidpAdEasy1.TherebinantplasmidpAdeasy1DMT1IREycinresistance.TherebinationpAdeasy1DMT1IREinalrepeats.PacⅠdigestedpAdEasy1DMT1IREent,plusasmallerfragmentof4.5kbdigestedbyPacⅠ.PCR,shoicroscopy.ConclusionTherebinantadenovirusis

5、successfullyconstructedandcanefficientlyexpressDMT1ologousrebination;Rebinantadenovirus　　近年來的研究顯示，帕金森?。≒D）病人腦內(nèi)有鐵代謝的改變，鐵離子含量在黑質(zhì)致密帶顯著增高，而在黑質(zhì)網(wǎng)狀帶無明顯變化[1,2]。但鐵在黑質(zhì)的選擇性聚積的原因至今還不是十分清楚。新的鐵轉(zhuǎn)運蛋白的發(fā)現(xiàn)是鐵代謝領(lǐng)域的重大突破，為解釋這一問題提供了重要的理論依據(jù)。二價金屬離子轉(zhuǎn)運蛋白1（DMT1）曾被稱為具有天然抗性的巨噬細(xì)胞蛋白2（Nram

6、p2），是新近發(fā)現(xiàn)的鐵轉(zhuǎn)運蛋白[3]。研究發(fā)現(xiàn)DMT1在腦內(nèi)廣泛表達(dá)[4]，提示DMT1在腦鐵轉(zhuǎn)運中起到非常重要的作用，可能參與了黑質(zhì)內(nèi)的鐵聚積。本研究構(gòu)建了攜帶DMT1IRE的重組腺病毒，為研究DMT1在鐵聚積中的作用提供實驗依據(jù)，有利于進(jìn)一步闡明PD的神經(jīng)元損傷機制?！　?材料與方法　　1.1材料　　實驗?zāi)苡脭y帶GFP報告基因的腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrackCMV，E1區(qū)和E3區(qū)缺失的復(fù)制缺陷5型腺病毒骨架質(zhì)粒pAdeasy1，大腸桿菌BJ5183、JM109和DH10B由本室保存。兔抗鼠DMT1

7、IRE單克隆抗體購自AlphaDiagnostic公司。βactin抗體為Sigma公司產(chǎn)品，HRP標(biāo)記的goatantirabbitIgG購自中山公司。人胚腎293細(xì)胞由本室保存。人胚腎293細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)為0.10的胎牛血清、105U/L青霉素、100mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，于37℃、體積分?jǐn)?shù)0.05CO2溫箱中培養(yǎng)。　　1.2方法　　1.2.1RTPCR擴增目的基因應(yīng)用Trizol提取RNA,應(yīng)用巢式PCR的方法擴增DMT1IRE基因，外側(cè)引物：5′AGGGTACCTCTAAGAA

8、CTCAGCCACTCAG3′，3′GGATACCCGAACACAGAACTTCGAACCA5′；內(nèi)側(cè)引物：5′AAGGTACCACCATGGTGCTGGGTCCTG3′，3′GTCTGCAAAACTTGTTTTCCGTTTTCGAACG5′。第一輪PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；然后94℃1min，63℃1min，72℃2min，擴增30個循環(huán)；最后72℃延伸10min。將第一輪PCR產(chǎn)物以1∶10