重組門冬酰胺酶制備表達純化

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1、酶類藥物--重組門冬酰胺酶Ⅱ表達和制備酶的分類門冬酰胺酶ⅡL?-天門冬酰胺酶AnsB能催化天門冬酰胺水解生成天冬氨酸和氨。淋巴瘤和白血病細胞通常不能合成天門冬酸胺，L?-天門冬酸胺酶將阻止癌細胞蛋白質(zhì)合成而導(dǎo)致癌細胞死亡。在臨床上，L?-天門冬酰胺酶已廣泛用于治療白血病和淋巴瘤。但目前國內(nèi)尚不能生產(chǎn)，國外也僅有低產(chǎn)酶能力的大腸桿菌野生株產(chǎn)品，生產(chǎn)成本高，藥價昂貴?；蚬こ叹a(chǎn)品既能填補國內(nèi)空白，又能大幅度降低生產(chǎn)成本。參考文獻1---重組與表達劉景晶，李晶，吳梧桐，胡梅清.《大腸桿菌L-天門冬酰胺酶Ⅱ基因的高效表達》中國藥科大學(xué)

2、生物化學(xué)教研室,南京210009南京鐵道醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室,南京2100092---提取與純化劉景晶,金健勤,戴海濱,吳梧桐.《大腸桿菌L門冬酸胺酶的提取和純化》中國藥科大學(xué)生化教研室,南京210009重組與表達材料限制酶Ncol、Hind?III及T4DNA連接酶，購自Promega公司；Taq酶、dNTP、IPTG購自華美公司；丙烯酰胺、N,N’?-甲叉雙丙烯酰胺、SDS購自sigma公司。pKK233?-2購自clonetech公司；pKK233?-ansB是將代PCR擴增得到的AnsB基因DNA用Ncol和Hind?III消

3、化后，定向插入pKK233?-2的多克隆位點而得到的重組質(zhì)粒。實驗方法PCR擴增AnsB基因重組質(zhì)粒PKK233-ansB的構(gòu)建陽性轉(zhuǎn)化子的篩選PCR擴增AnsB基因模板的制備：用接種環(huán)挑取CPU210009菌體少許，在裂解液(1﹪TritonX-100,2mmol/LTris-HClpH8.5,2mmol/LEDTA)1ml中振散，95C加熱處理液10min,吸取處理液5ul用于PCR。引物：E1:5‘-GGCCATGGAGTTTTTCAAAAAGACGGCACITGC一3′E2:5′-GGAAGCTTGAGAATGCCGTG

4、ATAC一3′11：5′-GGCCATGGAGT111TCAAAAAGACGCACTTGC一3′12:5′-GGAAGCTTAGACTGATTGAAGATCTGCTGG一3′擴增條件：84C變性1min;60C復(fù)性2min;72C延伸1min；循環(huán)28次。重組質(zhì)粒PKK233-ansB的構(gòu)建PcR擴增后的DNA片段及質(zhì)粒pKK233?-2同時分別用限制酶Ncol和Hindl消化并用瓊脂搪凝膠電泳分離和回收質(zhì)粒大片段；將消化后的DNA片段和電泳回收的質(zhì)粒大片段用T4.DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收后轉(zhuǎn)化HB101、71/

5、15、ATCc9637、JM107、cPU210009，篩選獲得相應(yīng)的陽性轉(zhuǎn)化子。陽性轉(zhuǎn)化子的篩選將涂布在含氨節(jié)青霉素的LB平板上生長出的單菌落用牙簽逐個挑入方格化的新鮮LB平板上，為每個克隆編號。平板置37C溫箱中過夜，待菌落形成后，用滅菌牙簽逐個挑取少量菌體，移入預(yù)先加有0.1mol/L硼酸緩沖液（pH8.4)50ul的酶標(biāo)板反應(yīng)孔內(nèi)，待菌體分散后，每孔各加入0.04mol/L天門冬酞胺底物溶液50ul,37C保溫15min，加奈氏試劑50ul，呈深棕紅色孔內(nèi)對應(yīng)的單菌落即為陽性轉(zhuǎn)化子。條件選擇酶的純度酶的濃度金屬離子pH溫度、時

6、間晶種酶的分離純化工作中的注意事項1.防止酶蛋白變性2.防止復(fù)因子丟失3.防止酶被蛋白水解酶降解提取純化蔗糖溶液提取法L-天冬酰胺酶的鑒定（肽圖分析）酶活力的測定酶分子量測定提取純化L-天門冬酰胺的提取（蔗糖溶液提取法）向菌體細胞中加入5倍體積的蔗糖抽提液（蔗糖40﹪，溶菌酶200mg/L,EDTA10mmol/L,pH7.5.）在30C震2小時，8000r/min離心30min,收集上清酶液。L-天冬氨酸酶的純化蔗糖溶液提取法獲得的酶液,加入硫酸銨至55﹪飽和度，調(diào)pH至7.0,室溫攪拌1小時,離心除去沉淀。上清液中加入硫酸銨

7、到90﹪飽和度，離心收集沉淀。沉淀物用50mmol/L、pH7.0磷酸緩沖液溶解并透析。透析后的酶液通過預(yù)先用10mmol/L、pH7.6的磷酸緩沖液平衡的DEAE-纖維素DE52層析柱（1.0×30cm）。用30mmol/L磷酸緩沖液洗脫,流速為40ml/h。每分鐘收集一定的洗脫液并于280處測定紫外吸收值，繪制洗脫曲線（如圖1）Ph4.8,通過預(yù)先用50mmol/L,pH4.9磷酸緩沖液平衡的CM-纖維素層析柱（1.0×8.0cm）,用50mmol/L、pH5.2磷酸緩沖液洗脫,收集顯示天門冬酞胺酶活力的組分,凍干后得天門冬酰胺凍

8、干粉。再進行稱量計算產(chǎn)量。L-天冬酰胺酶的鑒定（肽圖分析）取適量樣品加入1%NH4HCO3溶解至1.0mg/ml，按1∶30(W/W)加入胰蛋白酶，37±0.5℃保溫16h，50%冰醋酸終止反應(yīng)備用。色譜條件　流動相：A