資源描述：
《門冬酰胺酶的制備與分析.doc》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、重組天冬酰胺酶的制備、純化與鑒定趙雅嬙黃妤璠龍益如王敏敏白華山1原理本實驗主要是利用基因工程手段構(gòu)建L-天冬酰胺酶基因工程菌。L-天冬酰胺酶的生理作用主要體現(xiàn)于其抗癌抗腫瘤活性，特別是對非霍奇金淋巴瘤和ALL的有很強(qiáng)的抑制作用，目前適用于治療黑色素瘤、非何杰金病淋巴瘤等，也可以用于治療急性單核細(xì)胞性白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病等。目前，我國雖已投入生產(chǎn)L-天冬酰胺酶，但是較國外生產(chǎn)成本高、菌種產(chǎn)酶活性低，提取純化工藝落后。針對這些問題，本實驗對大腸桿菌重組L-天冬酰胺酶的制備、純化與鑒定進(jìn)行了系統(tǒng)性的探究，意圖改進(jìn)重組L-天冬酰胺酶的表達(dá)，優(yōu)化其純化工藝，分析其鑒定方法與性質(zhì)。本實驗主要
2、進(jìn)行了重組克隆載體和表達(dá)載體構(gòu)建、表達(dá)與鑒定的摸索；酶蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)條件分析；酶蛋白分離純化手段的比較和選擇，如蔗糖溶液提取、硫酸銨分級沉淀、CM-Sephadex和DEAE-Sepharose離子交換層析以及親和層析；重組蛋白酶活力監(jiān)控與本底蛋白活力測定等等。2實驗材料實驗儀器見表1.1。型號和生產(chǎn)廠家根據(jù)實驗室現(xiàn)有條件核定。表1.1實驗儀器或裝置儀器名稱型號生產(chǎn)廠家超凈工作臺PCR擴(kuò)增儀恒溫培養(yǎng)箱超低溫冰箱臺式離心機(jī)恒溫?fù)u床渦輪振蕩器高壓滅菌鍋蛋白電泳儀核酸電泳儀凝膠成像儀紫外分光光度計高效液相色譜儀掃描型紫外分光光度計制冰機(jī)超聲清洗機(jī) 實驗試劑和材料見表1.2。材質(zhì)或規(guī)格以及來源
3、根據(jù)實驗需求以及實驗室現(xiàn)有條件核定。表1.2試劑和材料試劑或材料材質(zhì)或規(guī)格來源E.coli野生型菌株CPU21009實驗室儲存pMD18-T50ng/μl寶生物工程有限公司pET-22b50ng/μl寶生物工程有限公司NdeⅠ10U/μl寶生物工程有限公司XhoⅠ10U/μl寶生物工程有限公司T4DNALigase350U/μl寶生物工程有限公司DNA純化試劑盒離心柱型天根生化科技（北京）有限公司Ni-NTA樹脂純化試劑盒離心柱型天根生化科技（北京）有限公司質(zhì)粒提取試劑盒離心柱型天根生化科技（北京）有限公司膠回收試劑盒離心柱型天根生化科技（北京）有限公司CaCl260mmol/L實驗室儲
4、存PBS50x實驗室儲存NaCl分析純Taq酶Mix分析純(NH4)2S2O8分析純C2H6OS分析純CH4O分析純冰乙酸分析純C2H6O分析純氨基丁三醇分析純考馬斯亮藍(lán)分析純SDS分析純Nessler's試劑Reagent,ACS美國Spectrum公司酵母粉分析純L-天冬酰胺分析純英國OXOID公司蛋白胨分析純甘氨酸分析純瓊脂糖分析純葡萄糖食品級TEMED優(yōu)級純溴酚藍(lán)分析純IPTG優(yōu)級純丙三醇分析純 3實驗思路與步驟本實驗設(shè)計從大腸桿菌野生型菌株CPU210009中提取總DNA，通過PCR擴(kuò)增目的基因ansB，隨后對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。后分別構(gòu)建重組克隆載體和表達(dá)載體，將克隆載體導(dǎo)入
5、宿主中，篩選陽性克隆，再經(jīng)雙酶切和測序鑒定。后將構(gòu)建的工程菌在合適的培養(yǎng)條件下發(fā)酵培養(yǎng)，利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，對重組蛋白進(jìn)行提取純化。再由考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳測定分子量以及進(jìn)行肽圖分析和紫外掃描并與天然產(chǎn)品比較。同時，實驗過程中以納氏試劑法監(jiān)控L-天冬酰胺酶酶活力，并計算回收率。3.1大腸桿菌L-天冬酰胺酶II基因ansB的獲取3.1.1大腸桿菌ansB基因的選擇與引物從NCBI中查找獲取大腸桿菌ansB的基因序列，其GeneID為947454，基因長度為1047bp,序列如下：1atggagtttttcaaaaagacggcacttgccgcactgg
6、ttatgggttttagtggtgcagca61ttggcattacccaatatcaccattttagcaaccggcgggaccattgccggtggtggtgac121tccgcaaccaaatctaactacacagtgggtaaagttggcgtagaaaatctggttaatgcg181gtgccgcaactaaaagacattgcgaacgttaaaggcgagcaggtagtgaatatcggctcc241caggacatgaacgataatgtctggctgacactggcgaaaaaaattaacaccgactgcgat301aagaccgacggcttcgtcat
7、tacccacggtaccgacacgatggaagaaactgcttacttc361ctcgacctgacggtgaaatgcgacaaaccggtggtgatggtcggcgcaatgcgtccgtcc421acgtctatgagcgcagacggtccattcaacctgtataacgcggtagtgaccgcagctgat481aaagcctccgccaaccgtggcgtgctggtagtgatgaatgacaccgtgc
